長期超低溫保存后真鯛精子的質量變化

陳亞坤, 劉清華 趙春彥 肖志忠 徐世宏 馬道遠 李 軍

(1. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島, 266071; 2. 中國科學院 研究生院, 北京 100039)

長期超低溫保存后真鯛精子的質量變化

陳亞坤1,2, 劉清華1, 趙春彥1, 肖志忠1, 徐世宏1, 馬道遠1, 李 軍1

(1. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島, 266071; 2. 中國科學院 研究生院, 北京 100039)

通過對精子運動率、受精率和超微結構的觀察, 研究了 2003～2009年分 5批冷凍保存的真鯛(Pagrus major)精子經1～73個月保存后質量變化情況。冷凍精子在40 ℃水浴中解凍, 大約100～110 s轉化為液態后取出, 用海水激活后觀察精子運動率, 人工受精 6～8 h后觀察受精率, 同時精子用 2.5%戊二醛前固定, 經處理后用掃描電鏡和透射電鏡觀察精子超微結構。結果表明, 冷凍精子的最高運動率(87.67%±2.52%)和受精率(71.33%±8.84%)都是2009年保存1個月的精子, 保存1, 13, 26個月的精子運動率和受精率差異不顯著(P＜0.05), 保存48個月后的精子運動率和受精率顯著低于保存1個月的精子(P＜0.05), 2003年保存的精子(73個月)運動率(50.67%±5.31%)和受精率最低(39.56%±0.69%)。精子的超微結構損傷主要包括精子頭部損傷, 線粒體損傷以及精子質膜的損傷。

低溫保存; 真鯛 (Pagrus major); 精子; 運動率; 受精率

超低溫保存技術是種質細胞長期保存的重要方法。魚類精子超低溫保存技術以及精子庫的建立, 對于魚類種質資源保護、遺傳改良以及水產養殖業可持續發展有著重要應用價值和理論意義。自從 1953年 Blaxter[1]成功冷凍保存大西洋鯡魚(Clupea harengus)精巢以來, 魚類種質細胞的低溫保存研究迅速開展。在過去的50多年中, 世界許多國家的科研工作者圍繞超低溫保存技術、冷凍損傷機理及凍精質量檢測等方面開展了大量研究工作, 現已建立200多種魚精液的超低溫保存技術, 有些魚種精液已應用于商業生產和科學研究[2]。

目前, 理論上普遍認為精子新陳代謝在低溫狀態下極其緩慢, 在液氮中甚至基本是停止的, 保存時間不會影響精子的運動率, 精子的生育力在液氮中能保存200～32 000 a[3]。以前的精子超低溫保存研究主要集中在短期保存, 樣品大多數在液氮中冷凍保存幾小時到幾周, 最長一般不超過 2 a, 并且認為精子在長期保存過程中質量不會有所變化[4～6]。然而,隨著超低溫保存技術和精子質量檢測手段的不斷發展完善, 長期冷凍保存后精子質量發生變化的現象也出現零星報道。鯉魚(Cyprinus carpio)精子的受精率在超低溫保存342 d后顯著低于保存14 d的受精率[7]; 鯰魚(Clarias gariepinus)精子超低溫保存14 d后孵化率為51%, 16個月后下降為41%[8], 類似現象在對蝦和人類精子超低溫保存中也有報道[9～11]。

本實驗室在真鯛(Pagrus major)精液超低溫保存過程中發現, 保存時間對凍精質量變化情況存在一定的影響, 并且 15%～18%的二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, 簡稱DMSO)對真鯛精子的保存效果較好[12]。因此, 本實驗對 2003～2009年用 15%DMSO作為抗凍劑保存1～73個月的真鯛精子進行檢測, 通過對運動率和受精率的觀察, 研究了真鯛精子經過不同超低溫保存時間后質量的變化情況, 并通過超微結構觀察檢測了精子的損傷情況。

1 材料和方法

1.1 親魚培養及配子采集

親魚(4雌, 6雄; 3～4 kg, 每年 10尾, 9～10齡 )暫養于青島中國科學院海洋研究所水族樓的方形水泥池中(長×寬×高： 3 m×2.5 m×2 m), 養殖水體溫度為16～18℃。每年3月中旬至5月下旬, 處于真鯛生殖盛期, 采用人工擠壓腹部的方法采集精液。操作前首先將雄魚置于 0.003%的丁香酚溶液中 3～5min至完全麻醉, 將魚體洗凈擦干, 輕輕擠壓腹部采集精液于器皿中, 操作過程中盡量避免海水、糞便、尿液等的污染。在 2003、2005、2007、2008和 2009年分別采集 5批精子進行超低溫冷凍保存。為避免不同批次精子的差異, 僅運動率高于 90%的精子用于實驗。精子的運動率是用自然海水以 1∶1000的比例進行稀釋激活精子, 在 100倍顯微鏡下觀察精子的運動情況, 計數100個精子中運動精子的個數, 運動精子個數與總計數精子個數的比例為精子的運動率。人工受精實驗所用卵子取自一條雌魚(質量好的卵占總卵比例高于95%的卵子用于實驗)。質量好的卵呈規則圓形, 顏色為半透明的微黃色。

1.2 藥品及儀器

DMSO購自SIGMA公司, 其他藥品均來自國藥集團化學試劑有限公司。抗凍劑稀釋液由 Hanks緩沖液配制(8 g/L NaCl, 0.4 g/ L KCl, 0.14 g/ L CaCl2,0.1 g/ L MgSO4·7H2O, 0.1 g/ L MgCl2·6H2O, 0.06 g/ L Na2HPO4·12H2O, 0.06 g/ L KH2PO4, 1g/ L 葡萄糖,0.35 g/ L NaHCO3)。程序降溫儀型號Kryo-360-1.7;光學顯微鏡型號 Nikon-YS-100; 液氮罐型號YDS-30B-80。

1.3 真鯛精子的冷凍保存

精液與 15%DMSO按 1∶3的體積比均勻混合,將混合液(共1.6 mL)置于2 mL的冷存管后轉入程序降溫儀, 按照預設程序進行冷凍處理。冷凍程序為： 0℃平衡 5 min, 然后以-20 ℃/min的速度從 0℃ 降到-150℃, 快速從程序降溫儀腔體內取出樣品投入到盛有液氮的液氮罐中保存。每一管樣品為一個平行樣, 每次實驗至少3個平行樣, 實驗重復3次。

1.4 真鯛精子長期超低溫保存后運動率觀察和受精實驗

對2003～2009年分5批保存1～73個月的精子進行水浴解凍, 水浴溫度為40 ℃。冷凍樣品在水浴中大約100～110 s,轉化為液態后取出。解凍的精子用自然海水以1∶250的比例進行稀釋激活, 然后顯微鏡下觀察精子的運動率。受精實驗參考文獻[12], 精子與卵的個數比例按500∶1真鯛標準化精卵比進行人工受精實驗, 對解凍精子進行人工受精, 受精后 6～8 h, 胚胎發育到囊胚期時計算受精率, 受精率為發育到囊胚期的胚胎數占最初卵總數的百分比(受精率＝囊胚期胚胎數/卵總數)。實驗重復3次。

1.5 真鯛精子超低溫保存后超微結構變化

鮮精和15%DMSO冷凍保存的凍精用2.5%戊二醛(0.2 mol/L, pH=7.4,磷酸緩沖液配制)進行前固定。掃描電鏡(scanning electron microscope, 簡稱 SEM)樣品, 經磷酸緩沖液(0.2 mol/L, pH=7.4)漂洗后, 用1%鋨酸后固定, 然后經酒精系列脫水, 醋酸異戊脂置換, 離子鍍膜等步驟后, 掃描電鏡(KYKY-1000B)下觀察、拍照。透射電鏡(transmission electron microscopy, 簡稱TEM)樣品, 按常規步驟進行預包埋、切塊后, 用 1%鋨酸固定, 梯度酒精脫水, 然后Epon812滲透包埋, 超薄切片, 經鈾鉛雙重染色后,透射電鏡(日立H-7000)下觀察、拍照。

1.6 統計分析

本實驗數據均用SPSS 16.0軟件進行分析(SPSS Inc. Chicago, Illinois, USA)。實驗數據以平均數±SD表示, 均數的比較采用One-Way ANOVA分析法, 差異顯著性分析采用 SNK(Student-Newman-Keuls’test)法。

2 結果

2.1 冷凍精子的運動率和受精率

2003～2009年分5批冷凍保存的精子, 經過不同時間的超低溫冷凍保存后其運動率和受精率參見表1。

表1 冷凍精子的運動率和受精率Tab.1 Motility and fertilization rate of post-thaw sperm

經過長期超低溫冷凍保存后, 冷凍精子的運動率和受精率隨保存時間的不同而存在顯著變化。冷凍精子的最高運動率和受精率都是2009年保存1個月的精子, 保存1, 13, 26個月的精子運動率和受精率差異不顯著(P＞0.05), 保存 48個月后的精子運動率和受精率顯著低于保存 1, 13, 26個月的精子(P＜0.05), 2003年保存的精子(73個月) 運動率和受精率最低。

2.2 真鯛精子超低溫保存后超微結構變化情況

鮮精和經超低溫保存后冷凍精子的超微結構如圖1和圖2。

圖1 鮮精和冷凍精子掃描電鏡照片(標尺為5μm)Fig. 1 The SEM photos of fresh and post-thaw sperm1-1.鮮精; 1-2.頭部破裂的精子; 1-3.線粒體脫落的精子; 1-4.膜損傷精子1-1. fresh sperm; 1-2. sperm with broken head; 1-3. sperm with mitochondria flaking off; 1-4. sperm with membrane damage

圖2 鮮精和冷凍精子透射電鏡照片(標尺為1 μm)Fig. 2 TEM photographs of fresh and post-thaw sperm2-1．鮮精, nu： 細胞核; ne： 核膜; mi： 線粒體; pm： 質膜; 2-2.精子核膜, 質膜消失, 線粒體正在溶解;2-3.線粒體消失的精子; 2-4.精子核膜消失, 質膜斷裂2-1. fresh sperm, nu： nucleus; ne： nuclear envelope; mi： mitochondrion; pm： plasmalemma; 2-2. sperm with nuclear envelope and plasmalemma loss and mitochondria in the process of dissolving; 2-3. sperm with mitochondrial loss; 2-4. sperm with disappeared nuclear envelope and broken plasmalemma

正常真鯛精子呈近似圓球形, 直徑為 1.3～1.4 μm,包括頭部, 中段和尾部 3部分結構, 其中頭部和中段緊密相接(圖 1-1和圖 2-1)。經過長期超低溫保存后的精子遭受不同程度的損傷, 主要有： 精子頭部損傷(圖 1-2), 精子線粒體損傷(圖 1-3和圖 2-2,2-3),以及精子質膜的損傷(圖1-4和圖2-2,2-4)。

3 討論

一般認為在液氮(-196 ℃)超低溫條件下, 精子處于休眠狀態, 代謝活動基本停止, 長時間冷凍保存對精液的質量沒有顯著影響。在魚類精子超低溫保存研究中, Suquet等[4]報道大菱鲆(Psetta maxima)精液保存9個月后, 凍精的受精率、存活率都與鮮精差異不顯著。冷凍保存 1a的大黃魚(Pseudosiaena crocea)精液受精率、孵化率與鮮精相近[5]。保存1周和 1a的大馬哈魚(Siniperca chuatsi)的冷凍精子,在受精率和孵化率方面與鮮精無顯著差別[6]。然而,本實驗對 2003～2009年保存的精子進行檢測, 結果表明保存時間會明顯影響真鯛精液超低溫保存的效果, 盡管保存1, 13, 26個月后精子運動率和受精率沒有顯著差別, 但保存43個月后精子的運動率和受精率顯著低于保存1, 13, 26個月的精子。對于其他魚種的研究, Kerby等[13]發現液氮中保存的條紋鱸魚(Morone saxatilis)精子的受精能力隨著保存時間的延長而降低。在鯉魚精液超低溫保存中也發現, 保存342 d的精子受精率顯著地低于保存14d的精子受精率[7]。同樣保存16個月的鯰魚精子孵化率顯著低于保存14 d的精子孵化率[8]。在人類精子超低溫冷凍保存研究中, Smith等[5]對凍貯的精液作了較長時間的觀察,結果發現在液氮中凍貯超過 36個月后,精子運動率顯著降低。從人工受精和臨床實踐角度看, 尹志康等[11]認為人類精液超低溫保存以不超過3a為最適凍貯時間。類似的結果在斑節對蝦(Penaeus monodon)精子的超低溫保存中也有報道[9], 研究者檢測了超低溫保存30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 d的精子質量, 保存 60 d的凍精活力與鮮精無差異, 但是保存90～120 d的凍精活力顯著降低。

迄今, 這種經長期冷凍保存后精子質量下降的現象在動物種質超低溫保存研究中還沒有合理的解釋, 對于植物低溫保存的研究, Walters等[14]提出,低溫并不能完全阻止種子的衰退, 并把種子的退化歸因于活性氧(reactive oxygen species,簡稱ROS)的產生和累積。在動物精子的超低溫保存過程中ROS過量產生也有報道[15]。過量ROS會攻擊細胞膜,導致膜發生脂質過氧化, 造成膜的損傷[15～17]。本實驗中通過超微結構觀察檢測到精子的損傷包括頭部破裂, 線粒體和膜損傷, 但膜的損傷是否與 ROS過量產生有關以及在長期保存過程中ROS是否存在累積,在魚類精子超低溫保存研究中未見報道。

本實驗表明, 長期超低溫保存并不能維持真鯛精子質量不變, 經過長期冷凍保存后, 精子的運動率和受精率隨時間的延長會顯著下降, 因此在建立精子庫進行種質保存時, 應該考慮到精子保存的最佳年限問題, 對精子進行定期更新,并且真鯛精子在長期保存過程中質量下降的機理及其是否與ROS有關有待深入探討研究。

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Quality change of Pagrus major sperm after long-term cryopreservation

CHEN Ya-kun1,2, LIU Qing-hua1, ZHAO Chun-yan1, XIAO Zhi-zhong1,XU Shi-hong1, Ma Dao-yuan1, LI Jun1
(1. Institute of Oceanology, the Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Graduate University, the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China)

Mar., 22, 2010

cryopreservation; Pagrus major; sperm; motility; fertilization rate

After cryopreservation (1-73 months), the quality of Pagrus major sperm, which was cryopreserved from 2003 to 2009 in 5 batches, was examined by observing motility, fertilization rate and ultrastructures. The cryopreserved sperm were thawed in 40oC water bath for 100～110 s. After activation with seawater, the motility of the sperm was estimated; 6-8 h after artificial fertilization, fertilization rate was examined; and after being fixed with by 2.5% glutaraldehyde, the ultrastructure of sperm was studied with scanning electron microscope and transmission electron microscope. The highest motility (87.67%±2.52%) and fertilization rate (71.33%± 8.84%) were obtained in sperm after a 1-month cryopreservation, even though they were not significantly different from those of the sperm after a 13-month or and 26-month cryopreservation (P＞0.05). After a 48-month cryopreservation, the motility and fertilization rate decreased significantly in comparison with those of sperm after a 1-month cryopreservation (P ＜0.05). The lowest motility (50.67% ± 5.31%) and fertilization rate (39.56% ± 0.69%) were obtained in sperm cryopreserved for 73 months; main ultrastructural damage was observed in the head, mitochondria and membranes of sperm.

Q331

A

1000-3096(2010)06-0050-05

2010-03-22;

2010-04-10

中國科學院海洋研究所知識創新領域前沿項目(Y02507101Q)

陳亞坤(1982-), 女, 吉林德惠人, 碩士研究生, 主要從事低溫生物學研究, E-mail：yakunchen@163.com; 李軍, 通信作者, 電話： 0532-82898716, E-mail：junli@qdio.ac.cn

(本文編輯： 譚雪靜)