黃芪對去卵巢大鼠骨組織的動態影響

潘靜華，張海嘯，2，李芳芳，尹智煒，李 恩

(1.福建醫科大學附屬廈門第一醫院，福建廈門 361003;2.中國中醫科學院，北京 100700;3.河北醫科大學基礎醫學院，石家莊 050017)

骨質疏松癥(Osteoporosis，OP)是絕經后婦女常見代謝性骨病，其特征是骨量減少、骨組織的顯微結構改變，骨折的危險性加大。據預測，我國原發性骨質疏松人數約為8800萬人，約占人口總數的6.97%。在我國女性60歲以上、男性75歲以上都患有不同程度的骨質疏松［1］。骨質疏松癥已經成為威脅老年人健康的重大問題之一。

骨質疏松的發病率以絕經后婦女人群為最高，可達50%以上，其主要原因是體內雌激素水平迅速降低，引起骨吸收相對增加，導致高轉換型骨質疏松的發生。大鼠去卵巢后所發生的骨丟失與絕經引起的骨丟失有許多共同之處，該模型已廣泛用于絕經后骨質疏松防治藥物的篩選及療效的評價［2、3］。

當前西藥治療骨質疏松常采用激素替代治療抑制高轉換型骨代謝和二磷酸鹽抑制骨吸收為主。但是由于雌激素(E2)可增加患子宮癌和乳腺癌的危險性、阿侖磷酸鈉(ALN)對胃腸道的副作用，限制了臨床的應用。因而在中醫理論的指導下，從天然植物藥中尋找有效的治療藥物或有效成分已成為關注的熱點。已有的研究結果表明，補益類中藥在骨質疏松的防治中占有重要的地位，達70%以上［4］。黃芪為補藥之長，能“助氣壯筋骨，長肉補血，實皮毛”。在臨床中常用于脾氣不足型骨質疏松的治療，文獻研究顯示其在抗骨質疏松復方中應用的頻率較高［4］。實驗研究已經證實，黃芪對骨質疏松的防治作用確切，但是其對去卵巢大鼠骨組織的動態影響尚未見報道。

1 材料

黃芪生藥切片購于石家莊市樂仁堂藥材公司;尼爾雌醇由北京四環制藥廠生產，批號20010801;堿性磷酸酶測定試劑盒由石家莊試劑公司生產;抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒為南京建成生物試劑公司產品;血鈣測定試劑盒為首都醫科大學科技中心生產;血磷測定試劑盒由石家莊試劑公司生產，其余試劑均為國產或進口分析純。

2 方法

2.1 動物模型的建立、分組和處理

6月齡SD雌性大鼠64只，購自同濟醫科大學實驗動物中心，動物合格證號020509。大鼠平均體重為256g±31g，隨機分為4組，即假手術組(Sham組)、卵巢切除組(OVX組)、卵巢切除 +黃芪組(HSW組)、卵巢切除 +尼爾雌醇組(E2組)，每組16只。動物麻醉后摘除雙側卵巢，Sham組切除同樣大小的脂肪。各組大鼠于卵巢切除30d后開始灌胃給藥，黃芪(1.8g/kg·d)、E2(0.1mg/kg，每周 2次)、Sham組與OVX組給予等量蒸餾水灌胃。于給藥后第15天將各組半數動物取血后處死。

2.2 中藥的制備

將黃芪生藥切片加3倍量蒸餾水浸潤4h，煮沸回流1.5h過濾，再加3倍量蒸餾水煮沸回流、過濾2次，合并3次濾液濃縮至0.18g/ml。

2.3 血清ALP和TRAP的測定

ALP采用氨基氨替吡啉酚法，TRAP采用對硝基苯磷酸二鈉法。

2.4 骨組織ALP和TRAP的測定

從－70℃取出骨標本，分離右后股骨，去除股骨端軟骨盤和連接組織，剪取股骨近心端約1/3，用冰冷的檸檬酸緩沖液沖洗骨髓腔數次直至沖洗液無紅色為止，快速稱重后加檸檬酸緩沖液于研缽(置于冰盒中)中研磨，約0.5g骨組織加4mL檸檬酸緩沖液，組織研磨液離心(4℃ 12000r 10min)，上清液－70℃保存，用于測定ALP和TRAP，總蛋白測定應用考馬斯亮藍法。

2.5 骨組織HOP、鈣、磷的測定

從－70℃取出骨標本，分離右后脛骨，去除脛骨端軟骨盤和連接組織，剪取脛骨近心端約1/3，用雙蒸水沖洗骨髓腔數次直至沖洗液無紅色為止。于烤箱中80℃ 48h烘干、稱重。每份骨樣本加6mol/L HCl 3ml高溫(125℃)消化，消化液分成2等份，第1份消化液稀釋后用甲基麝香草酚蘭比色法測定鈣，采用鉬酸銨氧化法測定磷;第2份消化液采用改良的氯氨-T氧化法測定骨HOP，用骨鈣總量/骨干重比值、骨磷總量/骨干重比值作為骨礦物質含量的指標，用骨(HOP×12.5)/(骨干重×0.9)的值作為骨有機質(bone organic)含量的指標。

2.6 骨組織病理切片

4%多聚甲醛固定，EDTA脫鈣后，常規組織脫水、透明、浸蠟、包埋、石蠟切片和HE染色，顯微鏡下觀察并照相，照相位置選擇股關節盤下10μm處。

2.7 數據統計分析

采用SPSS11.0統計軟件進行實驗數據處理，參數用均數±標準差(珋x±s)表示，組間比較用q檢驗。

3 結果

3.1 黃芪對骨有機質和礦物質的動態影響

表1顯示，與Sham組比較，2個階段OVX組的骨有機質、骨磷相對含量明顯降低(P<0.05和P<0.001)，骨鈣在治療15d時出現一定的降低，但未出現統計學差異，在第30天時方出現明顯的降低(P<0.05)。同OVX組比較，E2組治療15d和30d時的骨有機質、骨磷相對含量明顯升高(P<0.05和P<0.001)，HQ組的骨有機質相對含量在30d時出現明顯增加(P<0.001)，骨磷相對含量在治療的15d和30d時均出現統計學意義的升高，但是骨鈣在2個藥物組、2個時間段中均沒有明顯改善。

表1 去卵巢大鼠骨組織中有機質及礦物質鈣、磷相對含量的變化(%，珋x±s)

3.2 黃芪對ALP的動態影響

表2顯示，與Sham組比較，第15天時OVX組血清ALP活性無明顯差異，而骨ALP活性升高(P<0.05);在第30天時OVX組血清和骨ALP活性均明顯升高(P<0.05)。HQ組同OVX組比較，治療15d時血清和骨組織ALP活性沒有出現明顯的改變，而在30d時出現明顯的增加(P<0.05)，而E2組未見到明顯的變化。

表2 去卵巢大鼠血清和骨組織中ALP的變化(IU/L，珋x±s)

3.3 黃芪對TRAP的動態影響

表3顯示，在2個治療階段 OVX組的血清TRAP活性與Sham組比較，無明顯變化，而骨TRAP活性明顯增加(P<0.05)。同OVX組比較，E2組治療30d時骨TRAP活性有明顯降低(P<0.05)，而HQ組的TRAP活性僅見到降低趨勢，無統計學意義。

表3 去卵巢大鼠血清和骨組織中TRAP的變化(IU/L，珋x±s)

3.4 大鼠股骨組織病理改變

圖1顯示，在治療第15天、30天時，均可見到OVX組股骨的骨小梁稀疏變薄，骨髓腔擴大，可見到骨小梁斷裂，排列不整，且卵巢切除大鼠的骨組織稀疏狀態隨著時間的延長而加重。而黃芪和尼爾雌醇應用后，骨小梁有所增厚，數目增加，骨小梁斷裂減少。

圖1 去卵巢大鼠用藥治療30d時的股骨組織形態圖片(×40)

4 討論

骨組織由骨的基本多細胞單位(BMU)，通過破骨-成骨(骨轉換)的偶聯活動，自我更新、重建。伴隨絕經而來的雌激素不足，引起單位時間內BMU數量增加，即骨轉換頻率增多，并且在每次骨轉換中，破骨多于成骨(失偶聯)，骨代謝出現明顯負平衡，骨組織量減少加速。其病理變化主要表現為骨有機基質和骨礦物質的減少。骨有機質中的主要成分是骨膠原纖維，即通常所說的骨膠原(bone collagen)，約占骨有機質的90%。并且與膠原蛋白中羥脯氨酸含量相對一致，約占膠原氨基酸的12.5%左右，因此測定骨HOP含量可推知骨組織中有機質的含量。骨礦物質是由無定形的鈣磷混合物和鈣羥磷灰石晶體構成。體內鈣含量的99%存在于骨骼中，骨骼形成后，骨組織中的鈣并不是固定不變的。體內磷的85%存在于骨中，其主要作用是促進骨基質的合成和骨礦沉積。磷的釋放總伴隨骨的破壞，故測定鈣、磷的相對含量可推測骨中無機質的狀況［5］。

當破骨細胞活性占優勢時，骨膠原和骨磷、鈣的量減少，當成骨細胞活性占優勢時，骨膠原和骨磷、鈣的量增加，因此骨膠原和骨磷、鈣的量可以靈敏地反映骨組織破骨細胞和成骨細胞活性的相對強弱［6、7］。在本試驗中我們觀察到，在去卵巢骨質疏松大鼠的骨組織中，骨有機質、骨礦物質(鈣、磷)均隨時間的延長而呈進行性減少。在用藥治療15d時的骨有機質和骨磷升高，說明使用中藥黃芪可影響到骨組織，迅速改善骨有機質和骨磷的含量，使骨丟失有所減少。并且在大鼠去卵巢后的早期階段，骨磷的改變快于骨鈣，可能與鈣鹽的代謝較慢有關。

綜合病理和骨有機質和骨礦物質的檢測結果來看，黃芪與尼爾雌醇具有相似的治療作用。然而，其作用機理是否也相似呢?由于在骨重建過程中，破骨細胞分泌酸和酶來溶解吸收舊骨，成骨細胞分泌酶和骨膠原等蛋白以助骨鈣沉積，生成新骨。TRAP是破骨細胞的標志酶，其活性高低反映了破骨細胞活性的強弱，ALP是成骨細胞的標志酶［8］，其活性高低反映成骨細胞活性的強弱。在本實驗中我們發現，尼爾雌醇對TRAP活性的改變出現明顯抑制，而ALP活性并未見到明顯的改變;黃芪對血清和骨組織中成骨細胞的標志酶ALP活性明顯增強，而僅見到降低TRAP活性的趨勢。這說明短期應用尼爾雌醇主要抑制破骨細胞的活性，而黃芪主要促進成骨細胞的活性。

總之，通過本研究我們發現，黃芪能改善去卵巢大鼠骨有機質和骨磷的減少，改善骨組織形態，隨著用藥時程的增加，對骨組織的改善作用更為明顯;增強ALP活性，尤其骨組織ALP活性可能是黃芪防治骨質疏松的主要機理。

［1］ 樸俊紅，龐蓮萍，劉忠厚，等.中國人口狀況及原發性骨質疏松癥診斷標準和發生率［J］.中國骨質疏松雜志，2002，8(1):1-7.

［2］ Kaludn.The ovariectomized rat model of postmenopausal bone［J］.bone mineral，1991，15(3):175-182.

［3］ Michihiko U，Yutaka Y，Kunikazu T，et al.Tob deficiency super enhances osteoblastic activity after ovariectomy to block estrogend eficiency induced osteoporosis［J］.PNAS，2004，101:6653-6658.

［4］ 李芳芳，張海嘯.骨質疏松癥中醫復方用藥分析及單味藥研究進展［J］.河北中醫藥學報，2004，19(2):37-40.

［5］ 劉忠厚.骨質疏松學［M］.北京:科學出版社，1998.142.

［6］ Shen V，Birchman R，Xu R，et al.Short-Term Changes in Histomorphometric and Biochemical Turnover Markers and Bone Mineral Density in Estrogen and/or Dietary Calcium-Deficient Rats［J］.Bone，1995，16(1):149-156.

［7］ Srivastava AK，Vliet EL，Lewiecki EM，et al.Clinical use of serum and urine bone markers in the management of osteoporosis［J］.Curr Med Res Opin，2005，21(7):1015-1026.