天然產物抗氧化活性體外評價方法研究進展

劉微微，任 虹*，曹學麗，徐春明，王巧娥

(北京工商大學化學與環境工程學院，植物資源研究開發北京市重點實驗室，北京 100048)

天然產物抗氧化活性體外評價方法研究進展

劉微微，任 虹*，曹學麗，徐春明，王巧娥

(北京工商大學化學與環境工程學院，植物資源研究開發北京市重點實驗室，北京 100048)

客觀準確地評價天然抗氧化劑的抗氧化活性是抗氧化研究領域的熱點問題，本文對近年來天然產物抗氧化活性體外評價的方法及作用機制進行綜述，介紹目前常用的化學測定方法和細胞評價方法的原理及技術進展，并分析兩者的區別。

抗氧化劑；抗氧化活性；評價方法

Abstract：Antioxidant activity evaluation of natural products has become a hot topic. In this paper, current evaluation methods and antioxidation mechanisms of natural products have been reviewed. The principles and mechanisms of chemical determination and cellular evaluation of antioxidant activity have also been discussed. In addition, the difference is described between both methods.

Key words：antioxidant；chemical methods for evaluating antioxidant activity ；cellular evaluation for evaluating antioxidant activity

自由基是外層軌道含有未配對電子的基團，其化學性質活潑，且種類多，可攻擊細胞內包括 DNA、蛋白質、脂質、糖類、有機酸等幾乎所有生物分子，破壞性極強[1]。醫學研究表明，各種自由基所引發的氧化作用是導致身體中各組織器官損傷、病變的重要原因之一，人類許多重大疾病如動脈粥樣硬化、風濕性關節炎、糖尿病、癌癥以及衰老過程均與自由基造成的氧化損傷有關。因此，抗氧化活性物質的研究與開發成為國內外學者研究的熱點[2-4]。化學合成抗氧化劑如二丁基羥基甲苯(BHT)、丁基羥基茴香醚(BHA)、沒食子酸丙醋(PG)和特丁基對苯二酚(TBHQ)曾一度受到青睞，但通過動物實驗發現它們有一定毒性和致畸作用，使得人們對合成抗氧化劑產生了疑慮。天然抗氧化劑安全、無毒，符合人們對健康、安全的新需求。大量臨床研究表明，多種天然植物包括蔬菜、水果、谷物及中草藥等都含有黃酮、多酚、鞣質、皂苷及生物堿等抗氧化活性成分，在一定程度上減少了機體的氧化損傷[5-6]。因此從資源豐富的天然植物中活性跟蹤尋找高效、低毒、價廉的抗氧化劑成為該領域研究的一個重要方向，其中抗氧化活性評價方法對天然抗氧化劑的研究開發至關重要。目前研究評價抗氧化活性的方法主要有化學測定方法和細胞抗氧化評價方法，本文綜述了這兩類抗氧化活性測定方法的作用機制及其技術進展，并對它們進行了對比，以期為抗氧化性活性評價體系的建立提供參考。

1 抗氧化活性的化學測定方法

抗氧化的化學測定方法主要在化學反應容器中采用自氧化反應方法，測定抗氧化劑針對某一種或某一類自由基的清除或抑制作用，作用機制主要有以下幾點：1)抗脂質過氧化；2)清除或抑制自由基；3)影響抗氧化酶的生物活性；4)減少DNA的氧化損傷。

1.1 以脂質過氧化為基礎的測定方法

在生物體內，癌癥的發生及老化都與體內脂肪的氧化有關，脂質過氧化是一個十分復雜的過程，受許多因素干擾，在脂質過氧化反應早期，多不飽和脂肪酸碳鏈上可形成共軛雙鍵，可直接采用紫外分光光度法定量測定[7]，后期脂質最終氧化成醛、酮[8]。目前，脂質氧化多用化學、物理或感官的方法檢測，化學方法包括：過氧化值(peroxide value，PV) 法、共軛二烯過氧化物法、硫氰酸鐵法(ferric thioeyanate method，FTC)、硫代巴比妥酸法(thiobarbituric acid，TBA)、2,4-二硝基苯肼法、克雷斯實驗法(Kreis test)和茴香胺值(anisidine value)等，見表1。

李均等[9]對中華補血草根提取物對大豆卵磷脂脂質體體系中所產生的共軛二烯過氧化物和丙二醛的抑制率進行測定，結果發現提取物作用96h后對共軛二烯過氧化物和丙二醛的抑制率分別為79.03%和93.36%，比陽性對照槲皮素(對二者抑制率分別為84.67%和96.54%)略低，顯示中華補血草根提取物具有較明顯的抗氧化活性。硫氰酸鐵鹽(FTC)比色法基于酸性條件下脂質過氧化物可將Fe2+氧化成Fe3+，Fe3+與硫氰酸根離子形成紅色絡合物，在波長480～515nm處有最大吸收，吸光度越小表明物質的抗脂質過氧化能力越強。Rowena等[10]采用FTC法對5種菲律賓甘薯Dakol、Emelda、Violet、PSBSP和Haponita的抗氧化活性進行了測定，甲醇提取浸膏質量濃度為10mg/mL時，Haponita的抗氧化活性最強，抑制率為(99.4±0.9)%，Violet最弱，抑制率為(87.4±1.0)%，而且Violet的抗氧化活性與Dakol、Emelda、PSBSP的差異不顯著(P＞0.05)。Hanachi等[11]采用TBA法考察中草藥Berberis vulgaris的抗氧化活性，并以BHT和VE為參照，發現在相同質量濃度(0.2mg/mL)條件下，乙醇提取物活性最強，抑制率達(27.26±1.07)%，其次是BHT抑制率為(20.29±0.23)%、甲醇提取物為(16.80±0.23)%、VE為(6.68±0.25)%，水提取物活性最低，抑制率為(6.53±0.29)%。

1.2 以清除自由基為基礎的測定方法

體內自由基過剩，會對機體產生損傷。通過測定抗氧化劑清除自由基的能力來評價抗氧化活性，常用的方法有DPPH法、DMPD法、ORAC法等，見表2。

DPPH法[12]基于二苯代苦味酰基(DPPH)自由基在有機溶劑中的穩定性及其在波長517nm處的強吸收，抗氧化劑存在時，與其孤對電子配對而使光吸收消失或減弱，從而測得抗氧化劑對DPPH自由基的清除效果。因其快速、簡便、靈敏，該法成為評價天然抗氧化劑的最常用方法之一。Si等[13]從大青楊樹葉中分離得到兩個新的酚苷類化合物異大齒楊苷A(1)和B(2)、5個已知的酚苷類化合物大齒楊苷(3)、柳匍匐苷(4)、楊屬靈(5)、楊屬靈A(6)、柳皮苷(7)以及2個已知的酚酸類化合物P-香豆酸(8)和咖啡酸(9)。采用DPPH自由基清除法和TEAC法測定它們的抗氧化活性，發現化合物1～6和9具有較強的抗氧化活性，IC50值分別為6.68、6.61、6.75、6.84、6.76、6.79mmol/L和5.92mmol/L；TEAC值分別為1.21、1.28、1.26、1.05、1.69、1.60mmol/L和2.00mmol/L。

DMPD(二甲基對苯二胺)法由 Fogliano等[14]提出，在酸性條件下，DMPD被氧化生成穩定的DMPD+·，它在波長505nm處有最大吸收峰，根據加入抗氧化劑后吸光度的變化可測得樣品清除自由基的能力。Gil等[15]采用DMPD法和DPPH法測定比較石榴汁、紅葡萄酒、綠茶飲料的抗氧化活性，發現這兩種方法的實驗結果基本一致，都顯示出石榴汁的抗氧化活性(18～2TEAC)強于紅葡萄酒和綠茶飲料的活性(6～8TEAC)。

表1 脂質過氧化評價方法Table 1 Evaluation methods for lipid peroxidation

表2 自由基清除能力評價方法Table 2 Evaluation methods for scavenging capacity to free radicals

氧自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)法[16-17]采用β-藻紅蛋白(βphycoerythrin，β-PE)為熒光指示蛋白，以偶氮化合物2,2'-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽[2,2’-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride，AAPH]、Cu2+-H2O2體系作為脂過氧化自由基或羥自由基的來源，以VE 類似物Trolox為參照。β-PE受到自由基攻擊時，在一定的波長下熒光度不斷衰減，根據其熒光強度衰減曲線變化計算出樣品的自由基清除能力。Wang等[18]利用ORAC法對12種水果和5種果汁進行了抗氧化活性測定，其中草莓的ORAC值最高，其次為李子和橘子，而果汁中葡萄汁的ORAC值最高，其次為柚汁和番茄汁。

總自由基清除抗氧化能力(total peroxyl radical-trapping antioxidant parameter，TRAP) 法是由 Wayner 等[19]1985年提出，該法采用2,2-偶氮(2-脒基丙烷)(ABAP)作為過氧化物自由基的引發劑，以氧濃度的降低作為評價氧化的速率。Boumerfeg等[20]采用TRAP法研究漿果薯蕷的甲醇、乙酸乙酯、正丁醇萃取物的抗氧化活性，結果表明TRAP法得到的抗氧化活性順序與酶法(細胞色素C還原法)得到的順序基本一致，乙酸乙酯提取物的抗氧化活性＞氯仿提取物＞甲醇提取物。

Winston等[21]建立的總氧自由基清除能力(total oxyradical scavenging capacity，TOSC)法克服了機體某種特定抗氧化成分難以準確反映生物體實際抗氧化應激能力的局限性，TOSC法以氣相色譜或液相色譜為檢測手段檢測機體的總氧自由基清除能力，其優勢是能較全面地反映機體的總抗氧化能力，是目前測定總氧自由基的常用方法。Kwondo等[22]采用TOSC法研究9種日常飲料的抗氧化活性，并以抗壞血酸作為對照，結果發現9種飲料的抗氧化能力依次為：抗壞血酸＞烏龍茶＞紅茶＞茉莉花茶＞葡萄汁＞可可＞綠茶＞速溶咖啡＞李子汁＞咖啡，其中咖啡的抗氧化能力僅為抗壞血酸的1/7。

Benziei等[23-24]等建立鐵離子還原能力(ferric ion reducing antioxidant power，FRAP) 法，利用抗氧化劑將三吡啶三嗪三價鐵[TPTZ-Fe3+]還原為藍色的三吡啶三嗪二價鐵[TPTZ-Fe2+]，反應結果常以Fe2+當量表示。FRAP法簡便、快捷、靈敏度高、重現性好。Luximon等[25]采用FRAP和TEAC法研究了不同時期收獲的肉桂管的營養器官和生殖器官的抗氧化活性，結果表明生殖器官的抗氧化活性較強，其中豆莢的抗氧化活性最強，TEAC值為(992±0.4)μmol/L；FRAP值為(811±23)μmol/L。

Valkonen 等[26]還報道二氯熒光素二乙酸酯(dichorofluorescin - diacetane，DCFH-DA)法也是測定總的自由基清除能力。AAPH產生的過氧自由基氧化DCF H-DA生成二氯熒光黃(dichlorofluorescein，DCF)，DCF有強熒光(激發波長480nm，發射波長526nm)，在波長504nm處也有吸收，因此可用熒光法或分光光度法檢測。

1.3 測定抗氧化劑對抗氧化酶活性的影響

機體內清除自由基的酶系統主要有超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)等酶類組成，都是鐵卟啉蛋白酶，催化體內氧化酶的毒性產物H2O2分解。在正常情況下，機體代謝過程中產生的超氧陰離子自由基被細胞的SOD歧化為H2O2，后者再由細胞漿的CAT和GSH-Px催化降解為水和氧。

李興泰等[27]考察連翹醇提物的抗氧化活性，測定連翹醇提物對6周齡雌性小鼠血液中SOD、CAT和GSHPx酶活性的影響，以VE為陽性對照，發現當醇提物含量為0.4g/kg時，SOD、CAT和GSH-Px酶活力分別為(202.0±27)、(10.1±1.8)U/mg 蛋白和(44.8±9.5)U/mg 蛋白；當醇提物含量為0.8g/kg時，三者酶活力分別升高至(225±26)、(12.7±2.4)U/mg 蛋白和(47.6±5.8)U/mg 蛋白，隨醇提物含量遞增酶活增加。Jodynis-Liebert等[28]研究了耬斗花的乙醇和乙酸乙酯提取物及異金雀兒黃素對撲熱息痛介導的大鼠的氧化應激的影響，發現它們可以升高由撲熱息痛引起的各種抗氧化酶活性的降低，CAT升高50%，GSH-Px升高50%，谷胱甘肽還原酶升高50%，谷胱甘肽S2轉移酶升高60%，還減少肝中18%～48%的脂質過氧化。

1.4 DNA氧化損傷的測定

DNA是機體中攜帶遺傳信息的重要物質，也是最易受到氧自由基攻擊的生物大分子之一。正常情況下，機體可通過自身修復機制及時修補受損的DNA分子，維持遺傳物質的穩定性。但當發揮抗氧化作用的防御體系不健全時，機體細胞的自身修復系統不能及時地對損傷加以修復，最終導致各種疾病的發生。DNA被氧化時，鳥苷酸上C-8是最易發生損傷的位點，由此形成的8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)是評價DNA氧化損傷的最常用指標。彗星實驗是公認的DNA損傷檢測方法，通過檢測DNA鏈斷裂反映損傷情況。Braz等[29]對麻醉劑丙泊酚是否會對手術病人產生DNA損傷及脂質過氧化進行了研究，選擇進行了90min手術的病人為實驗者，丙泊酚濃度控制在2～4μg/mL之間，分別收集初期、麻醉誘導后、手術末期和術后第1天的靜脈血，采用彗星實驗測定白細胞DNA的損傷。彗星實驗及血漿動力學實驗表明4次取樣測定結果未有大區別，未發現白細胞中DNA損傷，血漿中丙二醛含量也未發生變化，表明丙泊酚不會誘導DNA損傷及脂質過氧化。

上述化學測定方法均是在一定的反應容器內通過自氧化方法測定天然產物的抗氧化活性，因具有簡單、快捷、處理量大等優點而被廣泛應用。這些方法對檢測生物制品、植物提取物以及單體化合物的體外抗氧化能力提供了重要的信息，并在研究氧化與疾病關系方面發揮著重要的作用。但隨著研究的不斷深入，抗氧化活性化學測定方法的局限性逐漸顯現，Wolfe等[30]采用ORAC、TEAC及FRAP三種方法對槲皮素、山奈酚、楊梅素、兒茶素、咖啡酸、沒食子酸、表兒茶素、表兒茶素酸酯共8個單體化合物的抗氧化活性進行測定，結果發現，在ORAC法中活性最強的3個為槲皮素、兒茶素和咖啡酸，在TEAC法中為沒食子酸、表兒茶素和表兒茶素酸酯，而咖啡酸活性很弱；在FRAP法中，最強的3個依次為槲皮素、楊梅素和山奈酚，而沒食子酸活性不強。大量實驗結果研究表明，沒有一種化學檢測方法可以全面、準確地評價待測物的抗氧化活性。

2 抗氧化活性的細胞評價方法

每種化學方法不可能全面評價抗氧化活性的原因主要在于[31-32]：1)抗氧化活性的化學測定方法無法真實模擬生理環境，沒有考慮藥物跨膜進入細胞、藥物吸收及其與載體或酶等生物大分子之間的相互作用。2)體內新陳代謝作用大大增加了活性物質抗氧化能力的不確定性，未考慮代謝毒性及生物有效利用性，許多情況下，有活性的化合物可能不是原本的化合物而是其代謝產物。3)生物體抗氧化反應途徑多樣復雜，各體系間相互作用，通常用不同方法測得的抗氧化活性的數據相關性很差，因為不同方法的側重點不同，如ORAC法、TRAP法和TOSC法測定的是抗氧化抑制體系中活性自由基引起的氧化還原反應的能力，而FRAP法測定的是被測物的還原能力。4)抗氧化劑與生物體液一般是混合的，其中每一種物質對不同測量方法的貢獻不同；通常，對于天然抗氧化劑，以抑制底物氧化降解的方法用的較多；對于生物試樣，則多用測定其清除自由基能力的方法。5) 測定的樣品大多為植物提取物，成分復雜，其抗氧化作用無法用單一的機制解釋。天然抗氧化劑往往具有多功能性，當用以一種抗氧化作用機理為主的方法進行測定時，就決定其測定體系氧化條件，而不同氧化條件又影響氧化反應動力學和體系組成，這些相關參數的影響不可能用一種單機理測定方法來評價。同時，抗氧化活性還受很多因素如在水相和有機相間分配效應、氧化條件和環境以及氧化底物物理狀態等的影響。動物模型實驗結果具有直接說明意義，但此方法昂貴耗時，不適宜初期篩選。因此為了尋找適合人體生理環境的、高效低毒的天然抗氧化劑，人們提出以細胞為載體評價抗氧化劑對細胞的抗氧化活性。

以細胞培養為基礎的活性篩選模型是用來研究藥物分配進入細胞膜、藥物吸收及與載體或酶等生物大分子相互作用的有效方法，目前，Liu等[33]和Wolfe等[34-35]提出了抗氧化活性的細胞篩選方法(cellular antioxidant activity assay，CAA)，以結腸癌細胞Caco-2、肝癌細胞HepG2及乳房癌細胞MCF-7為靶細胞，以2＇,7＇-二氯熒光黃二乙酯(DCFH-DA)為熒光探針，在細胞水平上檢測抗氧化劑對自由基氧化作用的抑制效果，初步篩選了25種水果的70%甲醇粗提物抗氧化活性，發現藍莓、石榴、草莓、蔓越桔、李子、櫻桃、蘋果、紅葡萄活性較強，EC50值分別為2.53、2.95、5.46、15.6、22.9、27.3、34.4mg/mL和45.3mg/mL，并檢測了其中黃酮類化合物的活性，發現B環3',4'-羥基取代的黃酮醇類如槲皮素、山奈酚、表兒茶素酸酯、木犀草素、桑黃素和楊梅素等的活性較強，EC50值分別為8.9、11.9、14.2、23.8、27.6μmol/L和31.1μmol/L，而異黃酮類不呈現活性。與傳統的“試管”化學測定方法相比，在開發抗氧化藥物方面，CAA評價方法更具可靠性和說服力，日益被人們認可，對日后抗氧化劑的研究開發將產生更大價值。

3 結 論

抗氧化活性測定的根本標準和目的是客觀、準確地評價抗氧化劑的抗氧化效果，既要測定待測物的含量、化學成分及其抗氧化能力，同時還要考慮抗氧化評價方法的靈敏性和穩定性。目前抗氧化活性評價方法很多，各有特色，各有優勢和局限性，不可能用一種方法全面準確地反映某一抗氧化劑的抗氧化活性，所以有必要在大量實驗研究的基礎上，基于不同用途，建立起一系列完整的抗氧化活性的評價體系和方法，以便客觀、準確地評價抗氧化效果，并確保結果的可靠性與重現性，從而高效率研究開發活性高、毒副作用低、特異性強的天然抗氧化劑。

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Progress in Evaluation Techniques for Antioxidant Activity of Natural Productsin vitro

LIU Wei-wei，REN Hong*，CAO Xue-li，XU Chun-ming，WANG Qiao-e
(Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development, College of Chemical and Environmental Engineering,Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

TS202.3

A

1002-6630(2010)17-0415-05

2009-12-09

國家“863”計劃項目(2007AA092400)

劉微微(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為微生物抗氧化次級代謝物研究。E-mail：liuweiwei731@163.com

*通信作者：任虹(1967—)，女，副研究員，博士，研究方向為天然活性產物化學。E-mail：renhong@th.btbu.edu.cn