凡納濱對蝦主要過敏原鑒定及酶法消減技術的研究

吳海明，胡志和*，王麗娟

(天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134)

凡納濱對蝦主要過敏原鑒定及酶法消減技術的研究

吳海明，胡志和*，王麗娟

(天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134)

以凡納濱對蝦為研究對象，用免疫印跡法檢測其主要過敏原蛋白組分；用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶對凡納濱對蝦水溶性蛋白水解，消減過敏原。并且通過間接酶聯免疫吸附實驗和致敏豚鼠全身免疫實驗對過敏原消減情況進行檢測，確定酶法消減過敏原條件。結果表明，凡納濱對蝦的主要過敏原為99、33、19kD以及14kD的蛋白質組分。胰蛋白酶最佳水解條件為：pH8.0，酶與底物比1:100(m/m，下同)，45℃，底物質量濃度3g/100mL，水解時間3h；木瓜蛋白酶最佳水解條件為pH6.5，酶與底物比1:100，60℃，底物質量濃度3g/100mL，水解時間3h；菠蘿蛋白酶最佳水解條件：pH7.5，酶與底物比1:100，55℃，底物質量濃度5g/100mL，水解時間3h。并且胰蛋白酶水解產物和木瓜蛋白酶水解產物對致敏豚鼠的全身免疫實驗安全性很好。

凡納濱對蝦；過敏原消減；蛋白酶水解；酶聯免疫

Abstract：The major allergenic protein components inLitopenaeus vannameiwere determined by Western blotting. Either trypsin, papain or bromelain was used to hydrolyze water-soluble proteins fromLitopenaeus vannameifor the elimination of allergens. ELISA and general immunity experiments in allergic guinea pigs were used to evaluate the elimination of allergens. The optimum hydrolysis conditions for achieving a maximum elimination of allergens were also determined. The results showed that the major allergens inLitopenaeus vannameiwere found to have molecular weights of 99, 33, 19 kD and 14 kD, respectively. The optimal conditions for trypsin hydrolysis were as follows:pH 8.0, hydrolysis temperature 45 ℃, enzyme-to-substrate ratio 1:100, protein concentration 3 g/100 mL and hydrolysis time 3 h; those for papain digestion were pH 6.5, hydrolysis temperature 60 ℃, enzyme-to-substrate ratio 1:100, protein concentration 3 g/100 mL and hydrolysis time of 3 h; and pH of 7.5, hydrolysis temperature of 55 ℃, enzyme-substrate ratio of 1:100, protein concentration of 5 g/100 mL and hydrolysis time of 3 h were found optimum for bromelain hydrolysis. The hydrolysates derived from trypsin and papain hydrolysis were safer for allergic guinea pigs.

Key words：Litopenaeus vannamei；allergen elimination；hydrolysis；ELISA

近年來食品安全問題受到越來越多人的重視，過敏疾病的發病率越來越高，全世界約有30%～40%的人患有各種各樣的過敏疾病，且發病率和死亡率呈逐年上升趨勢[1]，過敏疾病被世界衛生組織(WHO)認定為當今世界性的重大衛生問題之一。在西方發達國家，有2.5%的成年人和6%～8%的兒童會對某些食品過敏[2]。美國有600～700萬的過敏患者，每年平均有100～125例因食品過敏而致死的病例。在這些引起過敏的食品中，蝦及其制品產品是其中重要的一類[3-5]，有關食用或加工海產品導致過敏的報道層出不窮[6-11]。蛋白酶能夠對海蝦過敏原蛋白的結構進行破壞，破壞過敏原的抗原表位，從而降低過敏原的免疫活性。通過篩選出高效專一性的酶對過敏原進行定向酶解，可以有效的降低過敏原。本實驗以凡納濱對蝦為研究對象，對其蛋白質抽提后鑒定其主要過敏原，并用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶對其蛋白抽提物水解，通過間接酶聯免疫技術和致敏豚鼠全身免疫實驗對水解后過敏原消減的程度進行檢測。以期為開發低敏性凡納濱對蝦蝦制品提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮活的凡納濱對蝦 市售；伊利高蛋白脫脂奶粉內蒙古伊利實業集團股份有限公司。

海蝦過敏人血清(臨床癥狀均為喉嚨癢，嚴重時全身腫)、海蝦非過敏人血清 天津商業大學校醫院(自制)，血清均放在－25℃的冰箱中凍存。

胰蛋白酶(try p s in，250 U/mg)、木瓜蛋白酶(papain，2U/mg)、菠蘿蛋白酶(bromelain，6U/mg)、HRP標記的羊抗人IgE抗體 美國Sigma公司；Westren發光檢測試劑盒 普洛麥格(北京)生物技術有限公司；柯達XBT-1型醫用X射線膠片 北京世紀紅門科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；PHS-3C精密pH計 天津市盛邦科學儀器有限公司；KDC-160HR型高速冷凍離心機 科大創新股份有限公司中佳分公司；FA1104N型電子天平 上海精密科學儀器有限公司；JJ-2型組織搗碎勻漿機 常州國華電器有限公司；Centrifuge5424型離心機 Eppendorf公司；Trans-Blot SD cell電轉化儀、UNIVERSAL HOOD Ⅱ凝膠電泳成像儀 美國Bio-Rad公司；RT-6000型酶標分析儀 深圳雷杜生命科學股份有限公司。

1.3 實驗動物

英國種豚鼠，200～350g，健康，雌雄兼用。

1.4 方法

1.4.1 過敏原的提取

將蝦去殼去頭去尾去腸線后放在勻漿器中勻漿，1g組織大約用1mL的生理鹽水懸浮，將該懸浮液在冰上懸浮5min后加入4倍體積的冷丙酮(－20℃預冷過夜)，充分混勻，于0℃作用30min，期間混勻數次。4℃、8000r/min離心15min，收集沉淀物，沉淀物用冷丙酮重懸并混勻，再在4℃、8000r/min離心15min，將沉淀物轉移至干凈的濾紙上，分散并讓其在室溫下空氣中風干后為丙酮粉[12-13]。

取丙酮粉與抽提液(1mol/L KCl、0.5mmol/L DTT(1,4-dithiothreitol，pH7.4))按1:10(m/V)的比例抽提過夜，4℃、8000r/min離心15min后，取上清，沉淀用抽提液繼續抽提4h，離心取上清。透析過夜，兩次獲得的上清液合并后冷凍干燥，于－20℃的冰箱中保存備用。

1.4.2 免疫印跡(western-blotting)

采用SDS-PAGE電泳體系，分離膠12%，濃縮膠為5%進行電泳后將蛋白條帶轉印至PVDF膜上。待測蛋白條帶進行免疫印跡檢測，將膜置于封閉液(質量分數5%脫脂乳的TBST)中室溫封閉2h，期間確保膜與封閉液完全接觸。倒掉封閉液后用TBST洗膜3次，每次10min，洗膜結束后加一抗即過敏人血清(陰性對照加入非海蝦過敏人血清)反應1h，反應結束后用TBST洗滌10min，連續洗滌3次后，加入HRP標記的羊抗人IgE室溫下孵育1h，用TBST連續洗滌3次，每次10min，將Westren發光檢測試劑盒的A液和B液等體積混合后加到膜表面，反應30s后通過X光片進行曝光，顯影定影后水沖凈室溫下晾干，標記好蛋白標準后拍照。

1.4.3 3種蛋白酶水解凡納濱對蝦蛋白抽提物

1.4.3.1 胰蛋白酶水解凡納濱對蝦蛋白抽提物

在用胰蛋白酶對凡納濱對蝦蛋白抽提物進行水解時，以酶與底物比(m/m)、底物質量濃度和pH值為影響因素。在水解溫度45℃，pH8.0，底物質量濃度5g/100mL的條件下，改變酶與底物比(1:50、1:100、1:200、1:500)；在水解溫度45℃，pH8.0，酶與底物比1:100的條件下，改變底物質量濃度(3、5、7、9 g/100mL)；在水解溫度45℃，酶與底物比1:100，底物質量濃度5g/100mL的條件下，改變pH值(7.0、7.5、8.0、8.5)進行水解。水解3h后，將反應體系置于80℃，10min使酶失活，將水解物離心處理后進行冷凍干燥，然后對水解產物進行檢測。

1.4.3.2 木瓜蛋白酶水解凡納濱對蝦蛋白抽提物

在用木瓜蛋白酶對凡納濱對蝦蛋白抽提物進行水解時，以酶與底物比、底物質量濃度和pH值為影響因素。在水解溫度60℃、pH6.5、底物質量濃度5g/100mL的條件下，改變酶與底物比(1:50、1:100、1:200、1:500)；在水解溫度60℃、pH6.5、酶與底物比1:100的條件下，改變底物質量濃度(3、5、7、9g/100mL)；在水解溫度60℃、酶與底物比1:100、底物質量濃度5g/100mL的條件下，改變pH值(6.0、6.5、7.0、7.5)進行水解。水解3h后，將反應體系置于80℃，10min使酶失活，將水解物離心處理后進行冷凍干燥，然后對水解產物進行檢測。

1.4.3.3 菠蘿蛋白酶水解凡納濱對蝦蛋白抽提物

在用菠蘿蛋白酶對凡納濱對蝦蛋白抽提物進行水解時，以酶與底物比、底物質量濃度和pH值為影響因素。在水解溫度為55℃、pH7.0、底物質量濃度5g/100mL的條件下，改變酶與底物比(1:50、1:100、1:200、1:500)；在水解溫度為55℃、pH7.0、酶與底物比1:100的條件下，改變底物質量濃度(3、5、7、9g/100mL)；在水解溫度55℃、酶與底物比1:100、底物質量濃度5g/100mL的條件下，改變pH值(6.5、7.0、7.5、8.0)進行水解。水解3h后，將反應體系置于80℃，10min使酶失活，將水解物離心處理后進行冷凍干燥，然后對水解產物進行檢測。

1.4.4 間接酶聯免疫吸附法對水解物檢測

在對水解后的凡納濱對蝦水解物過敏性消減程度進行檢測時用未水解的蝦蛋白抽提物作為陽性對照，用正常人血清作為一抗作為陰性對照。

包被抗原時為減小誤差每6孔作為一組，每板有1組做空白，在酶標板中每孔加入100μL質量濃度為10mg/mL后4℃放置過夜后用洗滌液(PBST)洗滌3次，每次5min，在濾紙上拍干后每孔加入封閉液(含1g/100mL BSA的PBST)200μL，37℃水浴2h。封閉結束后，同樣用洗滌液洗滌3次，每次5min，拍干后每孔加一抗(含1g/100mL BSA的PBST將海蝦過敏人血清稀釋20倍)100μL，37℃水浴2h后洗滌，拍干后加入HRP標記的羊抗人IgE 37℃水浴2h后洗滌，拍干后每孔加入100μL鄰苯二胺底物液室溫放置15min，每孔加入50μL終止液(5mol/L H2SO4)后在492nm波長處測定其OD492nm值[14]。

1.4.5 豚鼠全身免疫實驗

根據斑點酶聯免疫和間接酶聯免疫的檢測結果，將3種蛋白酶(胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶)水解后對過敏原性消減最好條件的蛋白做豚鼠全身免疫實驗。每組6只豚鼠，雌雄各半，豚鼠腹腔注射3次(隔天注射)，每次1mL/只，7d后足趾靜脈注射2mL/只進行激發，分組見表1，激發后觀察動物現象[15]。

表1 豚鼠全身免疫實驗分組Table 1 Grouping of guinea pigs for general immunity experiments

2 結果與分析

2.1 凡納濱對蝦主要過敏原的鑒定

蝦蛋白質抽提物經SDS-PAGE后，經凝膠成像系統分析得知凡納濱對蝦的蛋白質組分有15條可辨蛋白帶，如圖1所示，分子質量為174、99、79、68、59、48、42、40、33、24、19、17、14、12、11kD，主要蛋白質組分分子質量為33kD。

圖1 凡納濱對蝦電泳蛋白質抽提物的SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE analysis of protein extracts fromLitopenaeus vannamei

圖2 凡納濱對蝦過敏原免疫印跡鑒定Fig.2 Western blotting analysis of allergens inLitopenaeus vannamei

從圖2的免疫印跡結果可以發現，不同的海蝦過敏人對凡納濱對蝦的免疫印跡結果幾乎相同。凡納濱對蝦蛋白質組分出現陽性反應的組分分子質量為99、68、59、48、33、19kD以及14kD。因為在免疫印跡檢測中不僅可以檢測出抗原抗體之間的特異性結合反應，還會有一些非抗原抗體之間的非特異性結合反應，為進一步說明哪些蛋白組分為研究的主要過敏原，用海蝦非過敏人的血清作為一抗進行免疫印跡實驗作為陰性對照，一位海蝦非過敏人血清和30位海蝦非過敏人混合血清作為一抗出現的非特異性蛋白幾乎相同，凡納濱對蝦的非特異性反應蛋白質組分分子質量為68、59kD和48kD，去除非特異性反應的蛋白組分可知，凡納濱對蝦的主要過敏原為99、33、19kD以及14kD的蛋白質組分。

2.2 間接酶聯免疫法對3種蛋白酶水解物檢測結果

在用蛋白酶水解過程中不同蛋白酶的水解溫度依次為：胰蛋白酶為45℃、木瓜蛋白酶為60℃、菠蘿蛋白酶為55℃，水解時間均為3h，控制酶與底物比、pH值和底物質量濃度3個參數的變化，結果見表2～4。

采用間接酶聯免疫吸附法對用上述3種蛋白酶水解后的凡納濱對蝦蛋白過敏原性消減程度檢測時，以未水解的蛋白抽提物為陽性對照組，同時以30位海蝦非過敏人血清作為一抗進行間接酶聯免疫檢測作為陰性對照組，陽性對照組的OD492nm值為0.585，陰性對照組的OD492nm值在0.03～0.05之間，陰性對照組的總體OD492nm均值為0.038。3種不同對蝦蛋白水解物的OD492nm值均低于陽性對照組的OD492nm值。經胰蛋白酶在pH8.0，酶與底物比1:100，45℃，底物質量濃度3g/100mL的條件下水解后檢測其OD492nm值為0.075；木瓜蛋白酶水解時在pH6.5，酶與底物比1:100，60℃，底物質量濃度3g/100mL的條件下水解后檢測其OD492nm值為0.054；菠蘿蛋白酶水解時在pH7.5，酶與底物比1:100，55℃，底物質量濃度5g/100mL的條件下水解后檢測其OD492nm值為0.148。經3種蛋白酶在其最佳水解條件下水解蝦蛋白，對其過敏原性消減較好，但也略高于陰性對照組的OD492nm值。

表2 胰蛋白酶水解蝦蛋白的產物與過敏人血清反應的OD492nm值(±s，n＝ 6)Table 2 OD value of trypsin-hydrolyzed shrimp protein reacted with allergic human serum

表2 胰蛋白酶水解蝦蛋白的產物與過敏人血清反應的OD492nm值(±s，n＝ 6)Table 2 OD value of trypsin-hydrolyzed shrimp protein reacted with allergic human serum

分組 酶與底物比 底物質量濃度/(g/100mL) pH 平均OD492nm值1 1:50 5 8.0 0.229±0.0262 1:100 5 8.0 0.243±0.0063 1:200 5 8.0 0.280±0.0174 1:500 5 8.0 0.412±0.0125 1:100 3 8.0 0.075±0.0216 1:100 5 8.0 0.243±0.0067 1:100 7 8.0 0.379±0.0298 1:100 9 8.0 0.380±0.0249 1:100 5 7.0 0.487±0.03310 1:100 5 7.5 0.432±0.02811 1:100 5 8.0 0.243±0.00612 1:100 5 8.5 0.283±0.010陽性對照組 0.585±0.014陰性對照組 0.038±0.001

表3 木瓜蛋白酶水解蝦蛋白的產物與過敏人血清反應的OD492nm值(±s，n＝ 6)Table 3 OD value of papain-hydrolyzed shrimp protein reacted with allergic human serum

表3 木瓜蛋白酶水解蝦蛋白的產物與過敏人血清反應的OD492nm值(±s，n＝ 6)Table 3 OD value of papain-hydrolyzed shrimp protein reacted with allergic human serum

分組 酶與底物比 底物質量濃度/(g/100mL) pH 平均OD492nm值1 1:50 5 6.5 0.202±0.0252 1:100 5 6.5 0.237±0.0173 1:200 5 6.5 0.267±0.0264 1:500 5 6.5 0.464±0.0305 1:100 3 6.5 0.054±0.0066 1:100 5 6.5 0.237±0.0177 1:100 7 6.5 0.445±0.0278 1:100 9 6.5 0.478±0.0329 1:100 5 6.0 0.347±0.03510 1:100 5 6.5 0.237±0.01711 1:100 5 7.0 0.261±0.02212 1:100 5 7.5 0.321±0.019陽性對照組 0.585±0.014陰性對照組 0.038±0.001

表4 菠蘿蛋白酶水解蝦蛋白的產物與過敏人血清反應的OD492nm值(±s，n＝ 6)Table 4 OD value of bromelain-hydrolyzed shrimp protein reacted with allergic human serum

表4 菠蘿蛋白酶水解蝦蛋白的產物與過敏人血清反應的OD492nm值(±s，n＝ 6)Table 4 OD value of bromelain-hydrolyzed shrimp protein reacted with allergic human serum

分組 酶與底物比 底物質量濃度/(g/100mL) pH 平均OD492nm值1 1:50 5 7.0 0.261±0.0212 1:100 5 7.0 0.265±0.0123 1:200 5 7.0 0.272±0.0234 1:500 5 7.0 0.462±0.0395 1:100 3 7.0 0.264±0.0116 1:100 5 7.0 0.265±0.0127 1:100 7 7.0 0.443±0.0408 1:100 9 7.0 0.464±0.0319 1:100 5 6.5 0.421±0.02710 1:100 5 7.0 0.265±0.01211 1:100 5 7.5 0.148±0.00712 1:100 5 8.0 0.288±0.015陽性對照組 0.585±0.014陰性對照組 0.038±0.001

2.3 豚鼠全身免疫實驗檢測過敏原消減結果

在豚鼠全身免疫實驗中所用陽性對照蛋白為未水解的凡納濱對蝦蛋白(組別1)，分別對3種蛋白酶在最佳水解條件下的蝦蛋白水解物進行動物全身免疫實驗。其中組別2～4，致敏蛋白為未水解的蝦蛋白，組別5～7依次為胰蛋白酶最佳水解物(OD492nm值為0.075)、木瓜蛋白酶最佳水解物(OD492nm值為0.054)、菠蘿蛋白酶最佳水解物(OD492nm值為0.148)。豚鼠全身免疫實驗結果見表5。

表5 豚鼠全身免疫實驗結果(n＝6)Table 5 Results of general immunity experiments in guinea pigs

從表5可以看出，用0.1g/100mL未水解蝦蛋白致敏豚鼠3次后，再經0.1g/100mL未水解蝦蛋白激發后發現，豚鼠死亡率為100%，說明過敏型豚鼠模型建立成功。用未水解的蝦蛋白致敏豚鼠，再經胰蛋白酶最佳水解物激發后豚鼠均正常，無死亡；用未水解的蝦蛋白致敏豚鼠，再經木瓜蛋白酶最佳水解物激發后豚鼠均正常，無死亡；用未水解的蝦蛋白致敏豚鼠，再經菠蘿蛋白酶最佳水解物激發后有兩例死亡，死亡率達33.3%。

3 討論與結論

通過SDS-PAGE以及免疫印跡的結果發現，出現強陽性抗原抗體特異性反應的蛋白并不一定是蛋白質組分含量相對多的條帶，例如凡納濱對蝦其蛋白質組分在14kD的蛋白含量明顯低于分子質量在33kD的蛋白組分，但在14kD的蛋白質組分免疫印跡結果明顯強于在33kD的蛋白質組分。

我國也有學者從凡納濱對蝦中提取海蝦的主要過敏原[16]。在初步分離的蛋白質組分中分子質量36kD的蛋白含量較高，用海蝦過敏者血清及陽性血清池鑒定主要過敏原，鑒定36kD的蛋白為主要過敏原。但在用陽性血清池鑒定該對蝦主要過敏原的實驗中，沒有陰性對照實驗，說明在36kD的蛋白未必是非特異性反應。在本實驗研究中凡納濱對蝦的蛋白初步分離組分中33kD的蛋白含量較高，但通過免疫印跡實驗的陰性對照發現，分子質量為33kD的組分不是其主要過敏原。

凡納濱對蝦在經胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶水解后，其過敏原性都有一定的消減作用，通過酶聯免疫的結果可知，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶對于凡納濱對蝦過敏原消除效果較好，動物實驗安全性也很高。

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Identification and Enzymatic Elimination of Major Allergens inLitopenaeus vannamei

WU Hai-ming，HU Zhi-he*，WANG Li-juan
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce,Tianjin 300134, China)

R392.8；S917

A

1002-6630(2010)17-0272-05

2010-01-19

“十一五”國家科技支撐計劃重大項目(2008BAD94B09)

吳海明(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：wuhaiming-22@163.com

*通信作者：胡志和(1962—)，男，教授，碩士，研究方向為食品生物技術。E-mail：hzhihe@tjcu.edu.cn