正交法優化酸性植酸酶固態發酵工藝

王 陶，李 文

(徐州工程學院食品工程學院，江蘇 徐州 221008)

正交法優化酸性植酸酶固態發酵工藝

王 陶，李 文

(徐州工程學院食品工程學院，江蘇 徐州 221008)

以麩皮為基本原料，對黑曲霉TW012產酸性植酸酶的固態發酵條件進行優化，以提高酸性植酸酶的產量。依據單因素試驗和正交試驗確定酸性植酸酶固態發酵的最佳工藝條件為：氮源(NH4)2SO4質量分數1.6%、pH5.0、含水量70%、30℃發酵5d，此時酸性植酸酶的酶活力可達346.576U/g干基，較優化前提高了23.77%。

酸性植酸酶；固態發酵；工藝；正交試驗

Abstract：The production process of acidic phytase based on the use of wheat bran as fermentation substrate in solid-state fermentation byAspergillus nigerTW012 was optimized using single factor method and orthogonal array design in this study.The optimum fermentation conditions were found to be:ammonium sulfate content in medium 1.6%, medium initial pH 5.0,medium water content 70%, fermentation temperature 30 ℃, and fermentation cycle 5 days. Under these optimum conditions,the maximum acidic phytase activity in the final fermentation product reached up to 346.576 U/g dry matter, 23.77% higher than before optimization.

Key words：acidic phytase；solid-state fermentation；technology；orthogonal array design

植酸酶是催化植酸及植酸鹽水解為肌醇與磷酸(磷酸鹽)的一類酶的總稱[1]。廣泛應用于食品工業和飼料工業中[2-5]。它能使植物性飼料中磷的利用率提高60%，糞便中磷的排出量減少40%，從而減少飼料中磷的添加量，降低對環境的污染[6]；它還可破壞植物性飼料或食品中植酸與礦物元素及蛋白質的親和力，提高礦物元素生物利用率和蛋白質的消化率，從而提高食品的營養價值和畜牧生產效益[7-10]。

植酸酶來源廣泛，包括植物、動物和微生物。由于來源于微生物的植酸酶作用范圍和穩定性較好，易規模化生產，近幾年的研究大都集中在微生物來源植酸酶[11]。根據最適pH值的不同，植酸酶可分為酸性植酸酶、中性植酸酶和堿性植酸酶[12]，而酸性植酸酶，包括有組氨酸酸性植酸酶(H A P)、紫色酸性植酸酶(PAP)、β-螺旋植酸酶(BPP)[13]；適用于胃pH值呈酸性的單胃動物以及少數魚類如虹鱒等[14]，其酶促反應的pH值有效作用范圍在2.5～5.5之間，能有效作用于單胃動物的消化道，并對選擇底物(如植酸) 具有高度特異活性[15]。目前，固態發酵產植酸酶的研究較少，還未見利用正交法優化酸性植酸酶固態發酵工藝的報道。考慮到固態發酵具有投資少、耗能低、工藝簡單和無“三廢”等優點，研究酸性植酸酶固態發酵工藝，以提高植酸酶的產量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸性植酸酶產生菌黑曲霉TW012由徐州工程學院食品工程學院實驗室保存。

植酸鈉(相應分析純補充純度級別) Sigma公司；鉬酸銨(分析純) 合肥工業大學化學試劑廠；三氯乙酸(分析純) 天津市河東區紅巖試劑廠。

1.2 儀器與設備

HH.B11.600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養箱 上海躍進醫療器械廠；DL-5低速大容量離心機 上海安亭科學儀器廠；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 培養基

斜面培養基：查氏合成培養基：NaNO33.0 g、K2HPO41g、KCl 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO40.01g、蔗糖30g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL；固體培養基：麩皮100g、質量分數為1. 6 %的(NH4)2SO4溶液165mL，pH 5. 2～5. 5。

1.4 培養方法

1.4.1 斜面培養

將接種后的斜面于28℃培養3d。

1.4.2 固體培養

250mL錐形瓶裝10g固體培養基，接入3環斜面活化后的黑曲霉孢子，28℃條件下靜置培養4d。

1.5 粗酶液的制備

將100mL質量分數為2 %的CaCl2溶液加入培養后的錐形瓶中，置于200r/min搖床上振蕩、抽提1h，過濾，取5mL濾液于4000r/min離心5min，得到植酸酶粗酶液。

1.6 單因素試驗

氮源種類對產酶的影響：固定其他條件，考察質量分數均為1%的硫酸銨、硝酸鈉、硝酸銨、尿素、牛肉膏對酶活力的影響，確定最佳氮源。

氮源添加量對產酶的影響：在最佳氮源的基礎上，考查其質量分數分別為0.4%、1.0%、1.6%、2.0%、2.2%時對酶活力的影響，確定最佳氮源添加量。

培養基初始pH值對產酶的影響：固定其他條件，考查培養基初始pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0時對酶活力的影響，確定最佳培養基初始p H值。

培養溫度對產酶的影響：固定其他條件，考查培養溫度分別為24、26、28、30、32、35℃時對酶活力的影響，確定最佳培養溫度。

培養時間對產酶的影響：固定其他條件，考查培養時間分別為3、4、5、6、7d對酶活力的影響，確定最佳培養時間。

培養基含水量對產酶的影響：固定其他條件，考查培養基含水量分別為60%、66%、70%、73%、77%、80%時對酶活力的影響，確定最佳培養基含水量。

1.7 正交試驗

以培養基初始pH值、培養溫度、培養時間以及培養基含水量4個因素進行L9(34)正交試驗，確定固態發酵產酸性植酸酶的最佳條件。正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

1.8 分析檢測

1.8.1 磷標準曲線的繪制

將4.0mmol/L磷酸二氫鉀標準溶液(pH 5.0的乙酸緩沖液配制)用乙酸緩沖液稀釋成濃度為0.0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mmol/L的溶液，分別吸取0.2mL標準磷溶液，加入0.8mL 6.25mmol/L植酸鈉溶液，37℃保溫30min，加入 1mL 質量分數5%的三氯乙酸(TCA)終止反應，再加入1mL 硫酸亞鐵鉬酸銨顯色液(質量分數1.5%鉬酸銨和質量分數2.7%硫酸亞鐵以體積比4:1混合)，靜置10min后在波長700nm處測定吸光度。標準空白為先在標準磷溶液中加入1mL 5%的TCA 使酶失活，再加入同體積的底物保溫。以無機磷濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，列出直線回歸方程。

1.8.2 粗酶液中植酸酶活力的測定

0.2 mL的酶稀釋液加入0.8mL 6.25mmol/L的植酸鈉，37℃保溫30min，加入1mL 5%的 TCA終止酶活反應，然后加入1mL硫酸亞鐵鉬酸銨顯色液，靜置10min后在波長700 nm處測定吸光度。對照為先在0.2mL的酶稀釋液中加入1mL 5%的TCA使酶失活，再加入同體積的底物保溫。根據標準曲線計算酶活力。

酶活力單位定義：以37℃、pH5.0條件下，1min從6.25mmol/L植酸鈉溶液中水解釋放lμmol無機磷所需要的酶量定義為一個酶活單位。

2 結果與分析

2.1 磷標準曲線

圖1 磷酸二氫鉀溶液濃度與吸光度標準曲線Fig.1 Standard curve of K2HPO4

由圖1可知，磷酸氫二鉀標準溶液的濃度與吸光度之間有良好的線性相關關系，回歸方程為y=0.0028x－0.0043，相關系數R=0.9989。

2.2 氮源種類對產酶的影響

表2 氮源種類對黑曲霉TW012產植酸酶酶活力的影響(±s)Table 2 Effect of nitrogen source type on acidic phytase production(±s)

表2 氮源種類對黑曲霉TW012產植酸酶酶活力的影響(±s)Table 2 Effect of nitrogen source type on acidic phytase production(±s)

氮源 空白 硫酸銨 硝酸鈉 硝酸銨 尿素 牛肉膏酶活力/198.330±2.211297.717±1.315251.073±2.406208.484±1.068226.875±1.542282.521±1.672(U/g)

由表2可見，在含氮量相同的條件下，硫酸銨作氮源產酶效果較好。這可能是由于發酵的固體基質麩皮中有一定的含氮量，但無機氮源較易被菌體利用，使菌體快速生長，以消耗培養基中釋放的無機磷，解除無機磷對植酸酶活力的反饋抑制。因此，后續實驗中使用硫酸銨作氮源。

2.3 氮源添加量對產酶的影響

圖2 培養基的含氮量對黑曲霉TW012產植酸酶酶活力的影響Fig.2 Effect of medium nitrogen content on acidic phytase production

由圖2可見，硫酸銨質量分數為1.6%時，植酸酶的酶活力最高。氮源添加量過低，無法保證產植酸酶所需的氮元素，菌體生長受限，產酶受影響；氮源添加量過高，反而導致不適的碳氮比，會抑制酶的活性，因此，氮源添加量控制在1.6%。

2.4 培養基初始pH值對產酶的影響

圖3 培養基初始pH值對黑曲霉TW012產植酸酶酶活力的影響Fig.3 Effect of medium initial pH on acidic phytase production

由圖3可知，產酶的最適初始pH值約為5.0，處于酸性植酸酶的有效作用范圍(2.5～5.5)之間，這也與此酶是酸性植酸酶是相一致的。

2.5 培養溫度對產酶的影響

圖4 培養溫度對黑曲霉TW012產植酸酶酶活力的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on acidic phytase production

溫度通過影響細胞膜的流動性以及生物大分子的活性來影響微生物的生物活性。由圖4可見，隨著培養溫度的升高，所產植酸酶的酶活力也隨之升高，但是溫度過高，菌體生長受影響，會導致所產酶的酶活力下降，在30℃時，酶活力最高。

2.6 培養時間對產酶的影響

圖5 培養時間對黑曲霉TW012產植酸酶酶活力的影響Fig.5 Effect of fermentation time on acidic phytase production

由圖5可見，發酵前期，主要是菌體細胞在生長，到了發酵的后期，主要是產酶，發酵終止時間應在酶活力最高時。考慮到前期主要是細胞生長，從發酵第3天開始測定酸性植酸酶的酶活力，直到第7天結束，其規律顯示在第5天時達到產酶最高峰。

2.7 培養基含水量對產酶的影響

由于麩皮的含水量不能滿足黑曲霉TW012的生長需求，因此需要附加水分，培養基的含水量為60%、66%、70%、73%、77%、80%時，酶活力變化如圖6所示。

圖6 培養基含水量對黑曲霉TW012產植酸酶酶活力的影響Fig.6 Effect of medium moisture content on acidic phytase production Table3 Orthogonal array layout and experimental results

由圖6可見，隨著培養基含水量的增加，酶活力先提高后下降，這可能是由于培養基含水量過低不利于菌體細胞的生長，含水量過高一方面會導致空氣中氧分壓降低，另一方面導致培養基內部溶氧不足，影響菌體細胞的透氣性，也不利于菌體細胞的生長代謝。所以培養基含水量控制在66%左右為宜。

2.8 正交試驗設計與數據分析

在單因素試驗基礎上，為考查各因素之間的交互作用，選擇不同pH值、溫度、培養時間以及培養基含水量為影響因素，選用L9(34)正交表進行正交試驗，因素水平如表2所示，結果見表3。

表3 正交試驗結果與分析Table 3 Orthogonal array layout and experimental results

由表3可知，各因素對酸性植酸酶活性的影響次序為C＞A＞D＞B，即培養時間＞pH值＞培養基含水量＞溫度，其最優方案為A1B2C2D3，即培養基的pH值為5.0、溫度為30℃、含水量為70%的條件下發酵5d。

將正交試驗優選組合A1B2C2D3和試驗設計中的最優組合A1B2C2D2分別進行實驗，平行3次，結果為：A1B2C2D3的植酸酶平均酶活力為346.576U/g，A1B2C2D2的酶活力為336.32U/g。差異顯著性分析結果表明，兩種組合的酶活力在α=0.05水平有顯著性差異。因此，正交優選組合為較優工藝，即最優的發酵條件為：培養基初始pH5.0、培養溫度30℃、培養基含水量為70%的條件下發酵5d。

2.9 產酶曲線

圖7 黑曲霉TW012固態發酵產植酸酶曲線Fig.7 Tim-course curve of acidic phytase production

在最佳發酵條件下，黑曲霉TW012產酸性植酸酶固態發酵的進程見圖7，隨著時間的推移，酶活逐漸增大，培養5d時，所產植酸酶的酶活力最高，為346.576 U/g，較優化前提高了23.77%，以后酶活力略有下降，有可能是隨發酵時間的延長，培養基的條件越來越不適合產酶。

3 結 論

通過單因素及正交試驗確定黑曲霉TW012產酸性植酸酶固態發酵的最適宜條件為：以麩皮為基質，氮源(NH4)2SO4添加量1.6%，培養基pH5.0，含水量70%，溫度30℃，發酵時間5 d。最優條件下，酶活力達346.576U/g。

麩皮作為一種廉價的資源，被廣泛應用于飼料和養殖業中，利用黑曲霉TW012固態發酵此類物質生產酸性植酸酶工藝簡單、成本低；同時可以釋放其中的磷，減少對環境的污染，具有重要意義。本實驗通過發酵條件優化，黑曲霉TW012固態發酵產酸性植酸酶的酶活力較優化前提高了23.77%。

[1] 趙翠燕, 許欽坤, 柯野. 植酸酶的來源及合成研究進展[J]. 中國飼料,2009(8):11-12.

[2] PEERS F G. The Phytase of Wheat[J]. Biochem J,1953, 53(1):102-110.

[3] 李路勝, 馮定遠. 生物技術生產飼料添加劑植酸酶[J]. 飼料廣角, 2003(11):27-28.

[4] MAGA J A. Phytate:its chemistry, occurrence, food interactions, nutritional significance, and methods of analysis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1982, 30:1-9.

[5] 陳惠, 王紅寧, 吳崎. 飼用植酸酶蛋白質工程研究進展[J]. 微生物學通報, 2004, 31(3):106-110.

[6] NELSON T S. The utilization of phytate phosphorus by poultry[J].Poult Sci, 1967, 46:862-871.

[7] SHARMA C B , GOEL M, IRSHAD M. Myoinositol hexaphosphate as a potential inhibitor ofα-amylases [J]. Phytochemistry, 1978, 17(2):201-204.

[8] 施安輝, 王光玉, 李桂杰. 目前國內外植酸酶研究進展[J]. 中國釀造,2005(5):5-10.

[9] 李大剛, 張秉勝, 張廣民. 植酸酶及其生產概述[J]. 上海畜牧獸醫通訊, 2003(1):8-9.

[10] WYSS M, PASAMONTES L. Biophysical characterization of fungal phytases(myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolases):molecular size, glycosylation pattern, and engineering of proteolyticresistance[J]. Appl Environ Microbiol, 1999, 65:359-366.

[11] 趙翠燕, 許欽坤, 柯野. 植酸酶的研究進展及應用前景[J]. 上海畜牧獸醫通訊, 2009(2):18-19.

[12] 曾繼蛟, 李英倫, 王鴻賓. 黑曲霉變異株A-828 酸性植酸酶的生物合成和性質的研究[J]. 菌物學報, 2009, 28(3):428-434.

[13] MULLANEY E J, ULLAH A H J. The term phytase comprises several different classes of enzymes[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2003, 312(1):179-184.

[14] 王亞茹, 姚斌, 曾虹, 等. 枯草芽孢桿菌中性植酸酶的純化和酶學性質[J]. 微生物學報, 2001, 41(2):198-203.

[15] 朱海東, 周曉蕓, 王蓓. 植酸酶的研究進展[J]. 飼料研究, 2005(1):13-15.

Orthogonal Array Optimization of Acidic Phytase Production by Solid-state Fermentation

WANG Tao，LI Wen
(College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

S816.7；Q933

A

1002-6630(2010)17-0286-04

2010-06-16

國家自然科學基金項目(10605027)；徐州工程學院青年課題(XKY2009122)

王陶(1976—)，男，講師，博士，研究方向為離子束生物工程學和資源微生物學。E-mail：wangtaohf@126.com