骨肽注射液細菌內(nèi)毒素定量檢查法探討

山西省長治市藥品檢驗所（046000）舒玉萍 王美云

骨肽注射液收載于《國家藥品標準》（化學(xué)藥品地方標準上升國家標準第十六冊），標準規(guī)定其熱原檢查法為家兔法。但由于家兔法操作繁瑣，靈敏度低，不能檢測內(nèi)毒素的含量，而定量法鱟試驗可進行靈敏而準確的內(nèi)毒素定量檢測。按照《中國藥典》2005年版附錄收載的方法，采用動態(tài)濁度法建立骨肽注射液細菌內(nèi)毒素檢查方法。

1 材料和儀器

細菌內(nèi)毒素工作標準品（批號為150601-200859，效價為120EU·支-1，中國藥品生物制品檢定所）；鱟試劑（批號為0708310，規(guī)格為1.25ml，湛江安度斯生物有限公司）；細菌內(nèi)毒素檢查用水（批號為050401，規(guī)格為5ml，湛江海洋生物制品廠）；骨肽注射液（批號為090501，吉林省輝南輝發(fā)制藥股份有限公司；批號為090130、090745，蚌埠宏生生化制藥廠；規(guī)格均為2ml：10mg）。BET-32M型細菌內(nèi)毒素測定儀（天津大學(xué)無線電廠），XW-80A旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；反應(yīng)器皿均經(jīng)250℃2h干熱滅菌。

2 方法與結(jié)果

2.1 細菌內(nèi)毒素限值的確立[1]按公式L=K·M-1計算，K為按規(guī)定的給藥途徑，即人用每公斤體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，靜脈注射藥品為5EU·（kg·h）-1，M為人用每公斤體重每小時最大給藥劑量。骨肽注射液在臨床上成人一次最大給藥劑量為20ml[2]，人均體重按60kg計算，因此計算出L=15EU·ml-1；最大的有效稀釋倍數(shù)MVD=cL·λ-1（動態(tài)濁度法鱟試驗：λ為標準曲線最低點濃度，λ=0.03125EU/ml，c=1ml·ml-1，MVD=480）。

2.2 實驗方法

2.2.1 標準曲線的制作及可靠性 細菌內(nèi)毒素檢查用水將細菌內(nèi)毒素工作標準品溶解，在漩渦混合器上混合15min后，再用細菌內(nèi)毒素檢查用水進行稀釋，使內(nèi)毒素終濃度分別為2.00、0.50、0.125、0.03125 EU·ml-1，每一步稀釋都在漩渦混合器上混合30s。各取0.3ml分別加入到預(yù)先加有0.1ml鱟試劑的反應(yīng)管中，混合均勻，插入BET-32M型細菌內(nèi)毒素測定儀進行檢測。每一濃度平行作3管，同時作陰性對照2管。實驗數(shù)據(jù)按最小二乘法進行統(tǒng)計運算，其標準曲線為LgT=2.9437－0.1300LgC，r=－0.998。其中，相關(guān)系數(shù)|r|=0.998>0.980，平行管的CV<10%，陰性對照在檢測線之外，故標準曲線有效。檢測結(jié)果見附表1。

2.2.2 干擾試驗 骨肽注射液最大的有效稀釋倍數(shù)為480。將090501批樣品制備成10、20、40、80倍的濃度系列，每個濃度分別取0.2ml樣品加0.1ml鱟試劑作為樣品檢查（S）；另外制備上述5個濃度含內(nèi)毒素0.5 EU·ml-1的系列，每個濃度分別取0.2ml加0.1ml鱟試劑作為樣品陽性對照（PPC）。將溶液分為兩組，每一濃度平行作2管，同時作陰性對照2管和陽性對照（0.5EU·ml-1）2管，插入BET-32M型細菌內(nèi)毒素測定儀進行檢測。干擾預(yù)試驗結(jié)果見附表2。結(jié)果顯示，骨肽注射液10、20倍稀釋液對鱟試劑凝集反應(yīng)具有增強作用，經(jīng)40倍、80倍稀釋的回收率均在50%～200%，經(jīng)40倍稀釋的回收率最接近100%且稀釋級低于80倍，因此可選擇樣品40倍稀釋的濃度作為日常檢查用。

附表1 標準曲線的可靠性

附表2 骨肽注射液干擾預(yù)試驗

附表3 骨肽注射液干擾試驗

為驗證骨肽注射液40倍稀釋濃度的有效性，進行了3個批號的骨肽注射液正式干擾試驗，以樣品40倍稀釋的濃度分別取0.2ml樣品加0.1ml鱟試劑作為樣品檢查（S），另制備含內(nèi)毒素0.5EU·ml-1的40倍稀釋樣品，分別取0.2ml加0.1ml鱟試劑作為樣品陽性對照組（PPC），將溶液分為兩組，每一濃度平行作2管，同時作陰性對照和陽性對照（0.5EU·ml-1）各2管，插入BET-32M型細菌內(nèi)毒素測定儀進行檢測，干擾試驗結(jié)果見附表3。結(jié)果表明，3個批號的骨肽注射液40倍稀釋濃度添加內(nèi)毒素的干擾試驗回收率均在50%～200%，對鱟試驗無干擾作用。

2.2.3 對比試驗 通過對三個批號的骨肽注射液進行檢查，并且與熱原檢查結(jié)果對比，均符合規(guī)定，表明定量檢查和熱原檢查結(jié)果相吻合。

3 討論

反應(yīng)時間是動態(tài)濁度法進行定量測定的重要參數(shù)，標志著鱟試劑反應(yīng)的快慢和樣品中細菌內(nèi)毒素的含量多少，該實驗用OD限值法。動態(tài)濁度法干擾試驗，是以樣品中添加內(nèi)毒素用平均回收率來判斷，回收率應(yīng)在50%～200%，表明樣品溶液對鱟試劑反應(yīng)無干擾影響。

本實驗選擇的標準曲線是4倍稀釋法，濃度范圍是2EU/ml～0.03125EU/ml，實驗一般選擇標準曲線中間濃度或曲線上的濃度，本實驗以0.5EU/ml作為樣品陽性管外加內(nèi)毒素值。

在設(shè)置的系列樣品溶液中，有兩個濃度在50%～200%，選擇最接近100%的回收率且低稀釋級作為最佳檢測濃度。動態(tài)濁度定量法檢測具有方便、快捷、定量、可以動態(tài)觀察反應(yīng)過程、干擾因素少等優(yōu)點，適合應(yīng)用和推廣。