分階段pH調控提高2-酮基-L-古龍酸生產

張靜，周景文，劉立明，劉杰，陳克杰，堵國成，陳堅

1 江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122 2 江南大學生物工程學院 生物系統與生物加工工程研究室，無錫 214122 3 江蘇江山制藥有限公司，靖江 214500

分階段pH調控提高2-酮基-L-古龍酸生產

張靜1,2，周景文1,2，劉立明1,2，劉杰3，陳克杰1,2，堵國成2，陳堅1,2

1 江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122 2 江南大學生物工程學院 生物系統與生物加工工程研究室，無錫 214122 3 江蘇江山制藥有限公司，靖江 214500

為了提高酮古龍酸菌Ketogulonicigenium vulgare和巨大芽胞桿菌Bacillus megaterium生產 2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)的生產效率，分析了pH對K.vulgare和B.megaterium生長和產酸的影響，發現K.vulgare和B.megaterium的最適生長pH值分別為6.0和8.0，但是K.vulgare的糖酸轉化活力在pH 7.0時達到最大值，因此提出了三階段pH控制策略(第一階段：0～8 h，pH 8.0；第二階段：8～20 h，pH 6.0；第三階段：20 h至發酵結束，pH 7.0)以促進K.vulgare生長和2-KLG生產。結果表明，三階段pH控制策略的實施進一步提高了2-KLG的產量(77.3 g/L)、生產強度(1.38 g/(L·h))和L-山梨糖消耗速率(1.42 g/(L·h))，分別比恒定pH 7.0時提高了9.7%、33.2%和25.7%。

pH調控策略，酮古龍酸菌，巨大芽胞桿菌

Abstract:The aim of this study was to improve the 2-keto-L-gulonic acid(2-KLG)production efficiency byKetogulonicigenium vulgareandBacillus megateriumby using multi-stage pH control strategy.The effect of pH on the cell growths and 2-KLG production showed that the optimum pH forK.vulgareandB.megateriumcell growth were 6.0 and 8.0, respectively, while the optimum pH for 2-KLG production was 7.0.Based on the above results, we developed a three-stage pH control strategy: the pH was kept at 8.0 during the first 8 h, then decreased to 6.0 for the following 12 h, and maintained at 7.0 to the end of fermentation.With this strategy, the titer, productivity of 2-KLG and L-sorbose consumption rate were achieved at 77.3 g/L, 1.38 g/(L·h)and 1.42 g/(L·h),respectively, which were 9.7%, 33.2% and 25.7% higher than the corresponding values of the single pH(pH 7.0)control model.

Keywords:pH control strategy,Ketogulonicigenium vulgare,Bacillus megaterium

以酮古龍酸菌Ketogulonicigenium vulgare[1]和巨大芽胞桿菌Bacillus megaterium為生產菌株，采用 L-山梨糖為底物合成維生素 C前體—2-酮基-L-古龍酸(2-keto-L-gulonic acid，2-KLG)是一典型的混菌發酵體系。其中，K.vulgare是產酸菌，含有轉化L-山梨糖為2-KLG的完整酶系，但其單獨生長微弱，產酸較少。B.megaterium作為K.vulgare的伴生菌，在形成芽胞的過程中裂解釋放活性物質促進K.vulgare生長和產酸[2]。我國科研工作者已在發酵優化[3-13]、兩菌關系[14]、酶學性質[15-16]等方面開展了大量卓有成效的研究工作。然而，制約 2-KLG產量、轉化率和生產強度進一步提高的關鍵在于如何調控兩菌之間的關系。盡管有研究表明分子量在30～50 kDa范圍內和大于100 kDa的大菌胞外液組分都具有促進K.vulgare轉化 L-山梨糖生成2-KLG的作用。趙世光等分離純化了一種58 kDa的B.megaterium胞外蛋白，明顯促進K.vulgare關鍵酶L-山梨糖脫氫酶的轉化效率[17]。但實際工業化生產中更希望發展一種高效、簡單、易于操作的調控手段，使B.megaterium適時地、定向地釋放胞內活性物質，以促進K.vulgare生長和產酸。由于K.vulgare和B.megaterium分屬不同的微生物種屬，相應的生理需求也不盡相同。基于這一思路，本研究在透徹研究pH對K.vulgare和B.megaterium生長影響的基礎上，導向性地采用分階段pH控制策略，實現了2-KLG的高效生產。這一針對混菌發酵體系中不同菌株提供不同pH需求的發酵控制策略，有別于以往的單菌發酵系統的分階段控制策略，為提高混菌發酵體系的生產效率，提供了新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 菌種

K.vulgare和B.megaterium由江蘇江山制藥有限公司提供。

1.2 培養基

種子和斜面培養基(g/L)：L-山梨糖 20，酵母膏3，蛋白胨 10，牛肉膏 3，玉米漿粉1.5，尿素1，碳酸鈣1，硫酸鎂0.2，磷酸二氫鉀1；瓊脂 20(斜面培養基)，定容至 1 L，pH 6.7～7.0，121℃滅菌 15 min。

發酵培養基(g/L)：L-山梨糖 80，尿素12，碳酸鈣 5，硫酸鎂 0.1，磷酸二氫鉀 1，玉米漿 5，定容至1 L，pH 6.7～7.0，121℃滅菌15 min。

1.3 培養條件

單獨K.vulgare培養：將菌種接種到液體種子培養基中于30℃、200 r/min培養32 h后，按體積濃度10%的接種量接種于裝有1.5 L發酵培養基的3 L發酵罐中培養72 h，攪拌轉速為400 r/min，通氣量為1.5 L/min，pH分別控制在5.0、6.0、7.0、8.0。

單獨B.megaterium培養：將菌種接種到液體種子培養基中于30℃、200 r/min培養9 h后，按體積濃度10%的接種量接種于裝有1.5 L發酵培養基的3 L發酵罐中培養72 h，攪拌轉速為400 r/min，通氣量為 1.5 L/min，pH 分別控制在 5.0、6.0、7.0、8.0。

混菌培養：將K.vulgare和B.megaterium以3∶1的比例接種于種子培養基中于30℃、200 r/min培養18 h后，按體積濃度10%的接種量接種于裝有1.5 L發酵培養基的3 L發酵罐中培養72 h，攪拌轉速為400 r/min，空氣通氣量為1.5 L/min，pH根據實驗設計控制。

1.4 分析方法

2-KLG和L-山梨糖的濃度用HPLC分析。發酵樣品用流動相 10倍稀釋，0.45 μm 濾膜過濾。Agilent 1100 system，BioRad公司Aminex HPX-87H色譜柱；流動相：2.75 μmol/L濃硫酸；柱溫：35℃；流速：0.6 mL/min；進樣量：5 μL；檢測器：示差折光檢測器。

細胞濃度測定采用血球計數法：取發酵液經適度稀釋，滴入血球計數板，在油鏡下分別計量兩菌數量。

糖酸轉化活力：在10 mL含2% L-山梨糖的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液(pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0)中，加入一定量的K.vulgare細胞，制成終濃度約為1×109CFU/mL的休止細胞懸液，30℃振蕩培養1 h，立即終止反應，用HPLC法測定2-KLG的生成量。糖酸轉化活力定義為：30℃每小時轉化L-山梨糖生成1 mg 2-KLG為一個糖酸轉化活力單位(U)。

2 結果

2.1 不同pH值對K.vulgare細胞生長的影響

采用3 mol/L Na2CO3或4 mol/L HCl將發酵過程中 pH值分別控制在 5.0、6.0、7.0、8.0以考察pH值對K.vulgare生長的影響(圖1)。結果表明，K.vulgare在pH 6.0時達到最大比生長速率的時間(22 h)比pH 5.0、pH 7.0和pH 8.0分別縮短了5 h、2 h、2 h。pH 6.0時K.vulgare最大比生長速率為0.098 h?1，比pH 5.0、pH 7.0和pH 8.0時的最大比生長速率分別提高了68%、14%和73%。pH為6.0時K.vulgare細胞達到對數末期(細胞比生長速率＜0.02)僅用了35 h，與其他pH條件下比較，縮短了4～6 h。這一結果表明，pH是影響K.vulgare生長的一個重要環境因素，其最適生長pH為6.0，過低或過高pH值均不利于細胞生長。

圖1 pH對K.vulgare生長的影響Fig.1 Effect of pH on theK.vulgaregrowth.curve 1: pH 5.0;curve 2: pH 6.0; curve 3: pH 7.0; curve 4: pH 8.0.

2.2 不同pH值對B.megaterium細胞生長和芽胞形成的影響

不同pH值對B.megaterium細胞生長的影響如圖2A所示。隨著發酵液中 pH不斷增加，B.megaterium最大比生長速率逐漸增加，pH 8.0時達到最大值，為0.74 h?1(4 h)，而pH 5.0時這一數值僅為0.29 h?1(12 h)。比生長速率的提高顯著縮短了細胞生長所需時間，因此，發酵液中pH為8.0時，B.megaterium培養僅8 h后就達到其對數生長末期。

B.megaterium在達到最大細胞濃度后迅速自溶或形成芽胞，導致營養細胞的數量劇減(圖2A)。在所研究的pH(pH 5.0～8.0)范圍內，B.megaterium衰亡速率隨著發酵液中pH的增加而逐漸降低，pH 8.0時細胞衰亡速率(0.10 h?1)為 pH 5.0(0.29 h?1)時的 36%(圖2A)。

圖2 pH對B.megaterium(A)和 B.megaterium芽胞(B)生長的影響Fig.2 Effect of pH on theB.megateriumgrowth(A)and the sporulation (B).curve 1: pH 5.0; curve 2: pH 6.0; curve 3:pH 7.0; curve 4: pH 8.0.

圖2B表明pH 7.0時B.megaterium達到最大芽胞比形成速率的時間僅為10 h(0.32 h?1)。另一方面，最大芽胞數量與其最大細胞濃度的比值隨著發酵液中pH的增加而增加，如pH 5.0時為3%，而pH 8.0時則升至21%。上述闡述表明，酸性pH值明顯抑制了B.megaterium芽胞形成率。在利用混菌發酵生產2-KLG的過程中，K.vulgare需要B.megaterium提供其賴以生長和合成 2-KLG的營養物質。若B.megaterium裂解后形成大量的芽胞，則不利于K.vulgare生長和2-KLG生產。這是因為B.megaterium在形成芽胞過程中，部分胞內活性物質殘存于芽胞中，導致其釋放的胞內活性物質減少。因此，為了進一步提高2-KLG的生產效率，宜將芽胞形成階段的pH值控制為酸性。

2.3 pH對糖酸轉化能力的影響

2-KLG的合成途徑主要涉及K.vulgare的3個關鍵酶：L-山梨糖脫氫酶、L-山梨酮脫氫酶和2-KLG還原酶。然而，上述三者的最適 pH值相差較大，其中L-山梨糖脫氫酶的最適pH值為6.86[18]，L-山梨酮脫氫酶的最適pH值大于9.0，2-KLG還原酶的最適pH為6.5[19]。其中L-山梨糖脫氫酶可以直接轉化L-山梨糖為2-KLG，是維生素C二步發酵的關鍵酶，而2-KLG還原酶可以催化 2-KLG還原為L-艾杜糖酸。靜息細胞體系中 pH值對K.vulgare糖酸轉化活力的影響如圖3所示，pH 7.0時，K.vulgare細胞的糖酸轉化能力達到最大。而酸性環境(pH＜7.0)或者堿性環境(pH＞7.0)均使糖酸轉化能力受到一定程度的抑制。

2.4 分階段pH控制策略促進2-KLG生產

綜合圖1～3，可得出如下結論：1)B.megaterium最適生長pH是8.0；2) 最佳B.megaterium裂解和最低芽胞生成率的pH為6.0以下；3)K.vulgare最適生長 pH是 6.0；4)合成 2-KLG的最佳 pH為7.0。上述結論表明，2-KLG發酵過程始終將pH控制為 7.0的發酵控制策略顯然不能高效地發揮微生物細胞的生理功能，導致發酵過程效率降低，而生產成本顯著提高。因此，需要在綜合考慮下述 3點因素：1)發酵初期使B.megaterium迅速生長并于對數末期后迅速裂解，釋放大量胞內活性物質；2)K.vulgare快速生長至最大細胞濃度；3)進一步產酸階段時2-KLG合成能力的基礎上，發展最適的pH控制策略：發酵初期(0～8 h)控制pH為8.0以促進B.megaterium生長；發酵中期(8～20 h)控制pH為6.0促進B.megaterium裂解，降低芽胞形成率和縮短K.vulgare生長延滯期；發酵后期(20 h至發酵結束)控制pH為7.0以提升2-KLG的合成能力，從而提高2-KLG產量和生產強度(圖4)。采用這一分階段pH值調控策略，顯著提高了2-KLG的合成能力和底物L-山梨糖的消耗能力。使2-KLG產量(77.3 g/L)、生產強度(1.38 g/(L·h))和 L-山梨糖消耗速率(1.42 g/(L·h))比單一 pH值(7.0)控制模式下相應數據分別提高了9.7%、33.2%和25.7%(表1)。然而，這一 pH控制策略并不能顯著提高 L-山梨糖消耗的總量及其轉化為2-KLG的轉化率。

圖3 pH對K.vulgare糖酸轉化活力的影響Fig.3 Effect of pH on conversion ability ofK.vulgare.

表1 分階段控制策略與恒定pH發酵的特征發酵參數比較Table 1 Fermentation properties of 2-KLG fermentation in constant pH 7.0 and in pH control by stages

圖4 不同pH控制策略對2-KLG發酵的影響Fig.4 Comparison of time courses between three-staged pH strategy(T)and constant pH strategy(C).(A)B.megaterium.(B)K.vulgare.(C)2-KLG.(D)L-sorbose consumption.

3 結論

本文在詳盡分析2-KLG發酵過程中pH如何影響B.megaterium和K.vulgare生長及2-KLG合成的基礎上，為進一步提高 2-KLG生產效率，針對性地提出0～8 h控制pH為8.0，8～20 h控制pH為6.0，發酵20 h后切換至7.0的pH分階段控制策略，使 2-KLG的產量、生產強度和 L-山梨糖消耗速率比控制pH為7.0模式下分別提高了9.7%、33.2%和25.7%。

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Enhancement of 2-keto-L-gulonic acid production using three-stage pH control strategy

Jing Zhang1,2, Jingwen Zhou1,2, Liming Liu1,2, Jie Liu3, Kejie Chen1,2, Guocheng Du2,and Jian Chen1,2
1 Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China 2 Biological Systems and Bio-processing Laboratory, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China 3 Jiangsu Jiangshan Pharmaceutical Co., Ltd., Jingjiang 214500, China

Received:January 29, 2010;Accepted:April 27, 2010

Supported by:National Science Fund for Distinguished Young Scholars(No.20625619), National Basic Research and Development Program of China(973 Program)(No.2007CB 714306), Innovative Research Team for University of Jiangsu Province, National High Technology Research and Development Program of China(863 Program)(No.2006AA020303), Key Projects in the National Science and Technology Pillar Program during the Eleventh Five-Year Plan Period(No.2007BAI46B02).

Corresponding author:Jian Chen.Tel: +86-510-85918309; E-mail: jchen@jiangnan.edu.cn Liming Liu.Tel: +86-510-85918307; E-mail: mingll@jiangnan.edu.cn國家杰出青年基金(No.20625619)，國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)(No.2007CB 714306)，江蘇高等學校優秀科技創新團隊項目，國家高技術研究發展計劃(863計劃)(No.2006AA020303)，“十一五”國家科技支撐計劃(No.2007BAI46B02)資助。