外源添加代謝中間體對產(chǎn)琥珀酸放線桿菌厭氧發(fā)酵制備丁二酸的影響

黃秀梅，姜岷，李建，鄭曉宇，楊卓娜，方曉江，葉貴子

南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院 材料化學工程國家重點實驗室，南京 210009

外源添加代謝中間體對產(chǎn)琥珀酸放線桿菌厭氧發(fā)酵制備丁二酸的影響

黃秀梅，姜岷，李建，鄭曉宇，楊卓娜，方曉江，葉貴子

南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院 材料化學工程國家重點實驗室，南京 210009

考察了外源添加中間代謝產(chǎn)物對菌體生長及發(fā)酵產(chǎn)酸的影響，結果表明添加 0.5 g/L磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)時丁二酸產(chǎn)量最高。圍繞產(chǎn)琥珀酸放線桿菌NJ113厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的代謝網(wǎng)絡進行代謝通量分析，發(fā)現(xiàn)添加PEP后己糖磷酸途徑(HMP)與糖酵解途徑(EMP)的通量比由39.4∶60.3提高至76.8∶22.6，解決了丁二酸合成過程中還原力不足的矛盾，導致PEP生成草酰乙酸的通量提高了23.8%，丁二酸代謝通量從99.8 mmol/(g DCW·h)增至124.4 mmol/(g DCW·h)，而副產(chǎn)物乙酸及甲酸的代謝通量分別降低了22.9%、15.4%；關鍵酶活分析結果表明，添加0.5 g/L PEP后PEP羧化激酶比酶活達到1910 U/mg，與對照相比提高了74.7%，而丙酮酸激酶的比酶活降低了67.5%。最終丁二酸濃度為29.1 g/L，收率達到76.2%，比未添加PEP時提高了11.0%。

產(chǎn)琥珀酸放線桿菌，丁二酸，代謝通量分析，中間代謝產(chǎn)物，酶活

Abstract:We investigated the effect of adding intermediate metabolites on cell growth and succinate production.The yield of succinic acid achieved to the highest when 0.5 g/L phosphoenolpyruvic acid(PEP)was added.According to the metabolic network ofActinobaccilus succinogenesNJ113, the metabolic flux was calculated by metabolic flux analysis.The ratio of hexose monophosphate pathway to glycolytic pathway increased from 39.4:60.3 to 76.8:22.6 after adding 0.5 g/L PEP, thus the reducing power was better balanced.The flux of PEP to oxaloacetate was 23.8% higher, which made the succinic acid flux improve from 99.8 mmol/(g DCW·h)to 124.4 mmol/(g DCW·h)and the flux of acetic acid and formic acid decreased by 22.9% and 15.4%,respectively.The key enzyme activity analysis showed that the specific activity of PEP carboxykinase reached to 1910 U/mg with 0.5 g/L PEP addition, which was 74.7% higher than the control; and the specific activity of pyruvate kinase decreased by 67.5%.Finally, the concentration of succinic acid was 29.1 g/L with the yield of 76.2%.

Keywords:Actinobaccilus succinogenes, succinic acid, metabolic flux analysis, intermediate metabolite, enzyme activity

丁二酸(又名琥珀酸)作為TCA循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物以及厭氧代謝的終端還原產(chǎn)物，廣泛存在于動物、植物以及微生物中[1-2]。傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法是石化法，其污染大、成本高，嚴重抑制了丁二酸作為大宗化學品的發(fā)展?jié)摿ΑｋS著生物工程技術的迅速發(fā)展和成熟，生物法生產(chǎn)丁二酸由于其高效率、環(huán)保性以及原料的可再生性而引起許多研究者的注意[3-4]。

近年來，基于途徑分析及代謝流分析的調控手段非常普遍[5]。潘軍華等[6]通過添加醋酸鹽、生物素、泛酸鹽等對 FP094菌株中由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、丙酮酸(PYR)和草酰乙酸(OAA)構成的“三角區(qū)”進行擾動，定性分析了此擾動對賴氨酸合成所需前提物代謝流量的調節(jié)機制，從而提高賴氨酸的產(chǎn)量。王帥等[7]在谷氨酸發(fā)酵研究中，發(fā)現(xiàn)添加少量乳酸會促進丙酮酸含量的增加，而丙酮酸是谷氨酸的前提物質，最終谷氨酸產(chǎn)量提高15%。劉立明等[8]研究了添加TCA循環(huán)中間產(chǎn)物可以促進光滑球擬酵母CCTCC M202019生長及積累丙酮酸的影響，得出OAA更能促進細胞的生長，丙酮酸得率及生產(chǎn)強度分別提高6%和24%。

生物法制備丁二酸的過程主要是將 EMP途徑中得到的PEP經(jīng)由TCA循環(huán)的還原支路，通過一步CO2固定和兩步還原反應生成丁二酸。該過程涉及的關鍵酶主要有磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶、蘋果酸脫氫酶、富馬酸酶和富馬酸還原酶。McKinlay等[9]利用13C原子標記分析代謝中間產(chǎn)物中的同位素位置研究丁二酸的代謝途徑，結果表明PEP是代謝過程中的一個重要節(jié)點，它將整個代謝流分配到兩個支路：一部分PEP生成OAA，繼而生成丁二酸，稱作 C4支路；另一部分 PEP生成 PYR，進而生成乙酸、甲酸等副產(chǎn)物，稱作C3支路。同時，草酰乙酸和蘋果酸(MAL)可經(jīng)脫羧反應生成丙酮酸，使代謝流在 C4和 C3支路間進行重新分配。因此，除PEP外，OAA、MAL和PYR也是代謝流分配中的重要節(jié)點。

目前，通過添加少量代謝中間體對丁二酸代謝途徑進行擾動的研究在國內外還未見報道。本研究主要從代謝通量分析角度，考察添加少量代謝中間產(chǎn)物(如PEP、PYR等)對產(chǎn)琥珀酸放線桿菌NJ113代謝通量分布及關鍵節(jié)點的影響，并結合關鍵酶酶活分析說明其影響機理，為優(yōu)化發(fā)酵過程控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

產(chǎn)琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenesNJ113由本實驗室自主篩選并保存。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 10(分消)，酵母膏5，NaHCO310，NaH2PO4·2H2O 9.6，K2HPO4·3H2O 15.5，pH 7.0，121℃滅菌 15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 40(分消)，酵母膏10，玉米漿 10，乙酸鈉 1.36，KH2PO43，MgCl2·6H2O 0.2，CaCl20.2，NaCl 1，Na2HPO4·12H2O 0.31，NaH2PO4·2H2O 1.6，pH 7.0，121℃滅菌 15 min(搖瓶培養(yǎng)需加20 g/L碳酸鎂)。

1.3 培養(yǎng)方法

種子采用100 mL血清瓶培養(yǎng)，裝液量50 mL，接種量 2%(種子是相同條件下活化后的培養(yǎng)物)，于37℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)11 h；血清瓶發(fā)酵培養(yǎng)裝液量 30 mL，接種量 3%，通無菌 100% CO2直至pH 6.8～7.0，搖床轉速180 r/min，在37℃下培養(yǎng) 20 h；3 L 發(fā)酵罐(BioFlo 110 fermenter，NBS)裝液量1.5 L，接種量7%，300 g/L Na2CO3控制過程pH 6.8，于 37℃、攪拌轉速 200 r/min、100% CO2(通氣量0.5 L/min)條件下培養(yǎng)。

1.4 分析方法

1.4.1 細胞干重測定

稱出干燥10 mL離心管重量(G1)，取4 mL發(fā)酵液置于離心管中，10 000 r/min離心5 min，棄上清液；再用4 mL蒸餾水清洗2次，離心，于60℃烘箱中干燥至恒重后稱重(G2)，則菌體干重(g/L)=(G2?G1)/4。

1.4.2 葡萄糖、乙醇及有機酸的測定

采用高效液相色譜法(戴安 Ultimate 3000系列)，色譜柱為Aminex? HPX-87H型離子排斥色譜柱(300 mm×7.8 mm id，5 μm)，以 0.005 mol/L H2SO4水溶液作為流動相，流速 0.6 mL/min，進樣體積20 μL，柱溫55℃，葡萄糖和乙醇利用示差折光檢測器檢測，丁二酸、乙酸、甲酸等利用紫外檢測器檢測，波長為215 nm。

1.4.3 酶活的測定

細胞抽提物的制備：取30 mL穩(wěn)定期的發(fā)酵液于50 mL離心管中，10 000 r/min、4℃離心10 min，棄去上清液，用5 mL 100 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0，含有 100 mmol/L Tris，20 mmol/L KCl，5 mmol/L MnSO4，2 mmol/L DTT，100 mmol/L EDTA)溶液洗滌2次后將細胞懸浮，置于冰槽中超聲破碎20 min；結束后10 000 r/min、4℃離心20 min，將上清液轉入另一離心管中，保存在?80℃冰箱待用。

蛋白質濃度的測定：Bradford法[10]，以牛血清白蛋白作為標準。

PEP羧化激酶(Pepck)酶活測定[11]體系：300 mmol/L Tris-HCl(pH 6.6)，300 mmol/L MgCl2，150 mmol/L MnCl2，1.125 mol/L NaHCO3，12 U/mL蘋果酸脫氫酶，100 mmol/L ADP·Na2，3 mmol/L NADH，150 mmol/L PEP，細胞提取液；所有底物于37℃水浴20 min，然后采用聯(lián)機紫外可見分光光度計于340 nm處測定反應的初速度。

丙酮酸激酶(Pyk)酶活測定體系[12]：300 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，300 mmol/L MgCl2，750 mmol/L KCl， 12 U/mL 乳酸脫氫酶，100 mmol/L ADP·Na2，3 mmol/L NADH，150 mmol/L PEP，細胞提取液；所有底物于37℃水浴20 min，然后采用聯(lián)機紫外可見分光光度計于 340 nm處測定反應的初速度。

蘋果酸脫氫酶(Mdh)酶活測定體系[11]：400 mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)，1.2 mmol/L NADH，15 mmol/L OAA，細胞提取液；所有底物于37℃水浴20 min，然后采用聯(lián)機紫外可見分光光度計于340 nm處測定反應的初速度。

酶活單位的定義：一個酶活力單位(U)定義為1 min催化1 nmol底物轉化為產(chǎn)物的量；比活力為每mg蛋白質所含的酶活力單位數(shù)。

式中，ΔA為吸光度隨時間的變化(min?1)，V為反應體系體積(mL)，ε為摩爾消光系數(shù)(NADH在 340 nm 時為 6.22×103L/(mol·cm))，v為樣品量(mL)，L為比色皿光徑(cm)，109為將 mol換算成nmol。

比活力(U/mg)=酶活力單位/蛋白濃度。

1.4.4 代謝過程及通量分析

根據(jù)相關文獻[11]和[13]，發(fā)酵產(chǎn)物以及酶活分析，建立了A.succinogenes以葡萄糖作為碳源合成丁二酸的代謝網(wǎng)絡，主要包括糖酵解(EMP)、磷酸己糖(HMP)、C3、C4、維持消耗以及生物量的合成途徑。在建立網(wǎng)絡模型時做了以下假設和簡化處理：1)細胞中的中間代謝物處于擬穩(wěn)態(tài)，在整個反應中不積累；2)只考慮主要中心碳代謝反應的物流平衡；3)忽略培養(yǎng)基中有機氮源對細胞合成通量的貢獻；4)能量供需平衡，即合成菌體與產(chǎn)物所需的能量和EMP、HMP產(chǎn)生的能量總數(shù)相等；5)在代謝過程中，由于一部分碳源用于細胞的維持、產(chǎn)能、CO2放出以及分泌其他一些未知的代謝產(chǎn)物等，造成碳源的不平衡現(xiàn)象，在代謝網(wǎng)絡通量的計算時忽略該部分通量；6)A.succinogene細胞組成參考McKinlay等[9]的研究，單一化為 CH2O0.5N0.2統(tǒng)一處理。整個代謝網(wǎng)絡包括 24個代謝反應方程，見表 1。

根據(jù)擬穩(wěn)態(tài)假設求解通量，即假設細胞內的中間代謝物濃度變化速率為0，有Ar=X，其中，A為胞內代謝反應計量系數(shù)矩陣(n×m)，r為代謝反應速率向量(m×1)，X為代謝物凈積累速率向量(n×1)，m與n分別為反應方程和代謝中間體的個數(shù)。整個代謝網(wǎng)絡包含24個代謝反應，其中中間代謝物為18個，自由度為6；可測速率有7個，即葡萄糖消耗速率以及丁二酸、乙酸、甲酸、乳酸、乙醇、細胞的生成速率。根據(jù)中間產(chǎn)物代謝平衡方程(表 2)列出矩陣A。由于可測定的速率大于自由度，該系統(tǒng)為超定系統(tǒng)，可用最小二乘法求得簡單解，利用MATLAB軟件線性規(guī)劃求得代謝分布。在代謝通量的計算中，均以100 mmol/(g DCW·h)的葡萄糖為計算基準，所有代謝通量r的單位均為mmol/(g DCW·h)。

表1 代謝反應方程Table 1 Metabolic reactions

2 結果與討論

2.1 外源添加中間代謝產(chǎn)物對發(fā)酵的影響

外源添加少量的代謝中間體可能對代謝網(wǎng)絡中關鍵酶活產(chǎn)生影響，從而影響代謝產(chǎn)物的分布情況。本實驗通過血清瓶發(fā)酵考察不同濃度的PEP、PYR、OAA及MAL對菌體生長及發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響，這4種物質在培養(yǎng)基中的濃度范圍為0～2 g/L，結果見表3。

表2 代謝通量方程Table 2 Equations of metabolic flux

表3 添加中間代謝產(chǎn)物對發(fā)酵的影響Table 3 Effects of adding intermediate metabolite on succinate fermentation

由表3可知，外源添加各種中間代謝對菌體濃度及丁二酸產(chǎn)量都有一定的影響。添加少量 PEP、OAA以及MAL對菌體生長及產(chǎn)酸均有一定的促進作用，其中添加PEP的效果最好。當培養(yǎng)基中PEP濃度為 0.5 g/L時菌體濃度及丁二酸產(chǎn)量都達到最大，丁二酸收率達到83.2%，較對照提高9.3%；而繼續(xù)增加 PEP濃度對菌體生長及丁二酸產(chǎn)量影響不明顯，甚至出現(xiàn)下降趨勢。因此，培養(yǎng)基中PEP的最佳添加濃度為0.5 g/L，以下實驗主要考察添加0.5 g/L PEP對發(fā)酵過程的影響。

2.2 外源添加PEP對發(fā)酵結果的影響

在3 L發(fā)酵罐中考察添加0.5 g/L PEP對NJ113厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響，結果見圖1和圖2。

圖1 不添加PEP的發(fā)酵過程曲線Fig.1 Process of succinic acid fermentation without addition of PEP.

圖2 添加0.5 g/L PEP的發(fā)酵結果Fig.2 Process of succinate fermentation with 0.5 g/L PEP added.

從圖1、圖2可以看出，添加PEP后整個發(fā)酵過程的變化趨勢與對照(不添加 PEP的發(fā)酵過程)一致。菌體在2～8 h內生長最快，8 h時細胞干重達到最大，雖然較對照的略低，但其穩(wěn)定期較長，衰亡速率較慢，最終丁二酸產(chǎn)量并沒有下降，丁二酸濃度為29.1 g/L，收率達到76.2%，比未添加PEP時的 65.2%提高了 11.0%。副產(chǎn)物乙酸、甲酸的濃度與對照相比均有所降低。PEP作為A.succinogenesNJ113代謝途徑的關鍵節(jié)點，少量PEP的加入可能擾亂了菌體的正常代謝，提高或降低了某些關鍵酶活，從而改變代謝產(chǎn)物的分布，最終導致丁二酸產(chǎn)量的提高。雖然添加PEP后發(fā)酵罐培養(yǎng)的丁二酸濃度較對照提高了，但是遠低于搖瓶培養(yǎng)的水平，原因可能是發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中流加的 Na2CO3溶液對發(fā)酵液產(chǎn)生了稀釋作用，從而導致罐子的丁二酸濃度較搖瓶的低。

2.3 外源添加PEP對代謝通量分布的影響

代謝通量可以直觀地反映不同途徑的相互作用以及圍繞代謝分支點的物質流分布，進而表征細胞的代謝能力[14]。為探討外源添加PEP的影響機理，對A.succinogenesNJ113進行代謝通量分析。利用菌體細胞穩(wěn)定且碳代謝流旺盛時(即穩(wěn)定期)的培養(yǎng)檢測參數(shù)作為代謝通量常數(shù)項，因此選擇10 h、10.5 h、11 h、11.5 h、12 h取樣分析發(fā)酵液中的菌體、葡萄糖、丁二酸、乙酸及甲酸的濃度，得到在11 h時的單位時間濃度變化率，并計算得到各反應(r1～rBM)的代謝通量。PEP添加與否的代謝通量分布情況如圖3所示。

從圖3中的通量分布情況可以看出，在發(fā)酵后期(11 h)消耗很少的碳源用于菌體的合成，添加0.5 g/L PEP的細胞合成通量與對照相比變化不大，底物葡萄糖主要用來合成產(chǎn)物丁二酸等。通量變化主要在通往HMP途徑、C3及C4途徑的摩爾通量上，其中PEP是影響丁二酸合成的關鍵節(jié)點，PYR是影響乙酸、甲酸等副產(chǎn)物生成的關鍵節(jié)點。添加PEP后流向C4途徑的通量r13比對照提高了23.8%，丁二酸代謝通量從 99.8 mmol/(g DCW·h)增至124.4 mmol/(g DCW·h)；同時，流向C3途徑的通量r6有所降低，導致副產(chǎn)物乙酸及甲酸的代謝通量分別降低了 22.9%、15.4%，使得更多的碳源用于合成產(chǎn)物丁二酸，最終提高了丁二酸產(chǎn)量。

圖3 添加PEP對代謝通量分布的影響(左邊：不添加PEP；右邊：添加PEP)Fig.3 Effects of adding PEP on metabolic flux distribution.Left flux from the control, right flux from the results of adding PEP.

2.4 外源添加PEP對關鍵酶活的影響

細胞代謝網(wǎng)絡中的每一個反應都是由某種特定的酶催化的，酶活力的大小可以直接反映各個反應的速率。外界環(huán)境(如pH、溫度等)的改變都會對酶活力產(chǎn)生不同程度的影響，從而影響代謝產(chǎn)物的分布情況。A.succinogenesNJ113代謝途徑中的關鍵節(jié)點是PEP及PYR[9]，PEP在Pepck作用下生成OAA進入C4途徑，之后OAA在Mdh作用下生成蘋果酸，最終生成目標產(chǎn)物丁二酸；而PEP也可以在Pyk作用下生成丙酮酸進入C3途徑，生成副產(chǎn)物乙酸、甲酸等。實驗測定穩(wěn)定期時(11 h)添加PEP后發(fā)酵過程的關鍵酶活，并與對照比較，結果見圖4。

由圖4可知，關鍵酶Pepck的比活力變化非常明顯，添加0.5 g/L PEP后Pepck比酶活達到1 910 U/mg，比對照提高了74.7%；同時Mdh也有所提高。而Pyk的比酶活有所降低，添加0.5 g/L PEP后Pyk為160 U/mg，與不添加PEP相比降低了67.5%。因此，Pepck酶活的提高使得進入C4途徑的碳流量增加，從而減少進入C3途徑的碳流量，這與Pyk酶活降低是一致的，最終合成更多的丁二酸，同時降低乙酸及甲酸的產(chǎn)量。

圖4 添加PEP對關鍵酶活的影響Fig.4 Effects of PEP added on the key enzyme activity.

2.5 外源添加PEP對還原力通量分布的影響

在A.succinogenesNJ113厭氧代謝途徑中，1 mol葡萄糖可以生成2 mol PEP以及2 mol NADH，而2 mol PEP生成2 mol丁二酸時需要消耗4 mol NADH，副產(chǎn)物乙酸、甲酸的形成過程不消耗也不產(chǎn)生 NADH，可見，產(chǎn)物丁二酸合成的矛盾是還原力不足，積累更多的NADH將有利于丁二酸的合成。代謝通量分析結果表明添加0.5 g/L PEP后HMP途徑與EMP途徑的通量比由對照的39.4∶60.3提高至76.8∶22.6，也就是說，通量更多地從G6P通過HMP途徑進行代謝，并大量合成NADPH，NADPH除一部分用于細胞合成外，剩下的可在轉氫酶的作用下轉化為NADH[15]用于丁二酸合成，解決了NADH不足的矛盾。代謝網(wǎng)絡中還原力[H]產(chǎn)生途徑的通量分配情況見表4。

從表4可以看出，NADH產(chǎn)生途徑主要有兩條，即GAP到PEP(r5)和PYR到ACA(r7)，添加PEP對NADH的通量沒有明顯的影響，但是NADPH的通量變化(r17)比較明顯，與對照相比提高了97.5%，導致還原力[H]總通量增加。由于兩種情況下的菌體濃度沒有明顯的變化，因此，添加PEP條件下有較多的NADPH可在轉氫酶的作用下生成NADH，從而用于丁二酸的合成，最終提高丁二酸/(乙酸+甲酸)的比例。

3 結論

外源添加代謝中間體對菌體生長及發(fā)酵產(chǎn)丁二酸均有一定的影響，其中添加0.5 g/L PEP的效果最好。應用代謝通量分析方法得出添加0.5 g/L PEP后HMP與 EMP途徑的通量比由 39.4∶60.3提高至76.8∶22.6，因此可以合成更多的 NADPH，進而轉化為NADH，解決了還原力不足的矛盾，導致PEP生成OAA的通量提高了23.8%，丁二酸代謝通量從99.8 mmol/(g DCW·h)增至 124.4 mmol/(g DCW·h)。最終丁二酸濃度為29.1 g/L，收率達到76.2%，比未添加PEP時提高了11.0%，同時副產(chǎn)物乙酸、甲酸等與對照相比均有所降低。關鍵酶活分析結果表明，添加0.5 g/L PEP后可顯著提高Pepck的比活力，PEP比酶活達到1 910 U/mg，與對照相比提高了74.7%；同時 Mdh也有所提高。而 Pyk的比酶活有所降低，添加PEP后Pyk為160 U/mg，較對照降低了67.5%。這與丁二酸產(chǎn)量增加、副產(chǎn)物產(chǎn)量減少是一致的。

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Effect of adding intermediate metabolites on succinate production by Actinobacillus succinogenes

Xiumei Huang, Min Jiang, Jian Li, Xiaoyu Zheng, Zhuona Yang, Xiaojiang Fang, and Guizi Ye
State Key Laboratory of Materials-oriented Chemical Engineering, College of Life Science and Pharmacy, Nanjing University of Technology,Nanjing 210009, China

Received:November 13, 2009;Accepted:February 23, 2010

Supported by:National Basic Research and Development Program of China(973 Program)(No.2009CB724701), National Natural Science Foundation of China(No.20606017), Foundation of State Key Laboratory of Materials-oriented Chemical Engineering, “Qinglan Project” of Jiangsu Province, “The Six Talent Summit” of Jiangsu Province(No.06-A-047).

Corresponding author:Min Jiang.Tel: +86-25-83172078; Fax: +86-25-83172075; E-mail: jiangmin@njut.edu.cn國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)(No.2009CB724701)，國家自然科學基金(No.20606017)，材料化學工程國家重點實驗室基金，江蘇省“青藍工程”，江蘇省“六大人才高峰”(No.06-A-047)資助。