采后一氧化氮處理調(diào)控番茄果實茉莉酸類物質(zhì)合成并提高灰霉病抗性

劉零怡，于萌萌，鄭 楊，生吉萍，申 琳,2,*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052)

采后一氧化氮處理調(diào)控番茄果實茉莉酸類物質(zhì)合成并提高灰霉病抗性

劉零怡1，于萌萌1，鄭 楊1，生吉萍1，申 琳1,2,*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052)

探討在番茄果實抗病性誘導過程中一氧化氮對茉莉酸類物質(zhì)的調(diào)節(jié)作用。以中蔬4號綠熟期番茄果實為材料，對其進行不同濃度一氧化氮處理，檢測不同處理對番茄果實抵抗病原菌侵染能力、一氧化氮水平、茉莉酸類物質(zhì)含量及其關(guān)鍵合成酶活性以及抗病酶苯丙氨酸解氨酶活性的影響。結(jié)果表明：不同濃度一氧化氮處理均能提高采后番茄果實抵抗病原菌侵染的能力，低濃度一氧化氮供體硝普鈉(0.02mmol/L)表現(xiàn)得更為明顯；低濃度硝普鈉能夠促進JAs含量及脂氧合酶活性的增加，高濃度處理則表現(xiàn)出抑制作用。

番茄果實；一氧化氮；茉莉酸類物質(zhì)；抗病性

我國是果蔬生產(chǎn)大國，每年有大量的新鮮果蔬從田間到餐桌被人們消費，但是由于病原菌侵染每年都會造成高達數(shù)十億美元損失[1]。如何有效控制采后病害，減少采后損失，是農(nóng)業(yè)領(lǐng)域亟待研究解決的重大課題。近年來利用植物的系統(tǒng)獲得性抗性(system acquired resistance，SAR)反應進行抗病誘導，可使植物器官快速獲得系統(tǒng)、持久的內(nèi)源抗性，且對病源細菌、真菌、病毒和線蟲的感染均有很強的廣譜抗性，為采后病害防治開辟了一條高效安全途徑，成為植物病理、生理和生物化學交叉學科的研究熱點。

一氧化氮(NO)是一種普遍存在于動物、植物和微生物體內(nèi)的信號分子，能夠調(diào)節(jié)植物的生長、發(fā)育，并參與植物體對各種生物和微生物脅迫反應的信息傳遞，尤其在植物抗病反應中起重要作用[2]。用外源NO供體處理擬南芥葉片會影響一系列抗性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性，如編碼苯丙氨酸解氨酶(PAL)的基因和病程相關(guān)蛋白1(PR-1)的基因等[3]。誘導植物抗病性是利用外界因子的刺激使植物產(chǎn)生抗病性能，利用植物自身的防御系統(tǒng)來達到抵御病蟲的目的。雖然植物并不像動物具有特定的免疫系統(tǒng)來抵抗病原物的侵害，但植物在長期的進化中形成了多種防御機制，包括與其他信號分子的互作反應，比如一氧化氮和茉莉酸類物質(zhì)。

茉莉酸類物質(zhì)(jasmonates，JAs)，包括茉莉酸(jasmonic acid，JA)及其甲酯類化合物(methyl jasmonate，MeJA)，是植物體內(nèi)普遍存在的一類激素，目前被認為是高等植物體內(nèi)的內(nèi)源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，具有廣泛的生理功能。JA作為一種重要的植物激素和SAR的重要組件，能夠誘導許多與脅迫防御相關(guān)的蛋白質(zhì)或次生代謝物質(zhì)的合成，如蛋白酶抑制劑、抗毒素等，進而構(gòu)建起植物的防御體系[4]。MeJA能夠明顯抑制馬鈴薯晚疫病的發(fā)生[5]，降低小蒼蘭對病原微生物的敏感性[6]。非病原的根際細菌(Rhizobacteria)可通過JA防御途徑引發(fā)誘導性系統(tǒng)抗性(induced systemic resistance，ISR)以抵御病原菌的侵害[7]。擬南芥突變體fad3-2、fad7-2、fad8缺乏亞麻酸，導致體內(nèi)MeJA含量極低，既不能積累JA/MeJA又不能誘導JA/MeJA相關(guān)基因的表達，使其對真菌病原很敏感，外施JA/MeJA后其抗真菌能力得到恢復[8]。這些都說明JA/MeJA在植物抗病過程中起重要作用。

最近的研究表明NO與JA信號途徑存在交叉。在傷反應過程中，一氧化氮可以誘導JA生物合成關(guān)鍵酶脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)活性的升高，影響JA的含量，進而參與茉莉酸的抗性反應[9]；然而也有文獻報道NO供體硝普鈉(sodium nitroprussiate，SNP)會抑制MeJA所誘導的防御基因的表達[10]。對NO的研究人們以前主要關(guān)注其直接與抗性反應或者誘導抗性之間的關(guān)系，但是植物體以及采后果蔬作為一個有生命的組織體，任何物質(zhì)對它們的作用都不是單方面的，而是一種系統(tǒng)作用。國內(nèi)外目前對NO、JA都有一定的研究，但在誘導抗性過程中兩者直接互作關(guān)系的研究還未展開，迄今為止在誘導抗病性過程中有關(guān)NO和JA相互關(guān)系的文獻也未見報道。本實驗的主要目的是明確在誘導抗病過程中一氧化氮對茉莉酸類物質(zhì)的具體調(diào)控作用，為今后果蔬采后病害的防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

材料所用綠熟期番茄果實材料中蔬4號播種于北京小湯山特菜基地大棚中，花期標記。采摘、運輸過程中避免機械傷害。挑選大小均勻，成熟度相對一致，無病蟲害、機械傷的果實，釋放田間熱，24h后進行樣品采集。采摘時去除番茄果實果蒂。

番茄果實在3%次氯酸鈉溶液中浸泡2min 進行表面消毒，隨后用清水洗凈，自然晾干后進行真空滲透處理。本實驗共設(shè)4組處理：(A)0.5mmol/L NO供體硝普鈉(SNP)；(B)0.02mmol/L SNP；(C)0.5mmol/L NO抑制劑(L-NNA)；(D)蒸餾水(對照)處理，處理 0、30min，6、1 2、2 4 h，2、4、6 d后取樣。

1.2 試劑與儀器

NO 供體SNP、NO抑制劑L-NNA、亞油酸、L-苯丙氨酸 Sigma公司；NO水平測定試劑盒(酶聯(lián)免疫試劑盒) 南京建成生物工程研究所；JAs 含量測定試劑盒 中國農(nóng)業(yè)大學作物化學控制實驗室；其他常用試劑和藥品為國產(chǎn)分析純。

高速臺式冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；UVIKON XL型多功能紫外分光光度計 Secomam 公司；恒溫水浴鍋 北京靖衛(wèi)科學儀器廠；酶聯(lián)免疫分光光度計 上海雷勃分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 果實損傷接種及發(fā)病率統(tǒng)計

參照Fan等的方法[11]，略有改動。

1.3.2 NO水平測定

番茄果實NO水平采用南京建成生物工程研究所研制的NO試劑盒進行測定。

1.3.3 茉莉酸類物質(zhì)含量測定

植物體內(nèi)茉莉酸類物質(zhì)的含量采用酶聯(lián)免疫試劑盒測定。取1.0g果皮樣品，加入5mL樣品提取液，冰浴研磨，4℃條件下提取4h，12000×g離心15min。上清液過 C18固相萃取柱，過完柱的樣品進行真空濃縮干燥，用樣品稀釋液定容，進行酶聯(lián)免疫樣品測定。重復3次。

1.3.4 脂氧合酶活性測定

參照生吉萍等方法[12]。取果實1.0g 加入5mL 0.1mmol/L pH6.8 磷酸緩沖液冷凍研磨，靜置20min 后15000×g離心5min 。將2.7mL pH6.8的磷酸緩沖液加0.2mL底物，在25℃條件下保溫30min取酶液0.1mL加入上述混合液中，立即振蕩使之充分混勻。以未加酶液的為參照，測定234nm波長處3～4min吸光度(A)。重復3次。

1.3.5 苯丙氨酸解氨酶活性測定

參考Zucker的方法[13]并稍加改進。稱取樣品1g用6mL 0.2mol/L pH8.8的硼酸緩沖液研磨，10000×g離心10min，上清液為酶提取液。取上清液1mL，加2mL硼酸緩沖液，1mL 0.02mol/LL-苯丙酸氨溶液(對照為3mL硼酸緩沖液)，在30℃恒溫水浴中保溫30min，然后立即加入0.2mL 6mol/L HCl終止反應。在290nm波長處測定吸光度(A)。以每30min吸光度改變0.01為1個酶活力單位(U)。重復3次。1.3.6 統(tǒng)計分析

采用Excel軟件對檢測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析與制圖，用SPSS 17.0進行方差分析與顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度一氧化氮處理對采后番茄果實抵抗病原菌侵染的影響

圖1 不同濃度一氧化氮處理對采后番茄果實灰霉菌損傷接種發(fā)病率和病斑面積的影響Fig.1 Effect of the concentration of nitric oxide on disease incidence and lesion area of tomato fruits inoculated withBotrytis cinereaPers.(2105 conidia per mL)

不同濃度一氧化氮處理均能夠提高采后番茄果實抵抗灰霉病原菌Botrytis cinereaPers.侵染的能力，降低接種發(fā)病率和病斑面積。接種2d 后，空白與處理組輕微發(fā)病，病斑面積不明顯。隨著儲藏時間延長，發(fā)病率增高，病斑面積不斷擴大，不同處理組之間的差異表現(xiàn)得更加明顯，對照組發(fā)病率和病斑面積都顯著高于處理組，對照組儲藏4d 的發(fā)病率已達到83.3%，0.5mmol/L高濃度一氧化氮、0.5mmol/L一氧化氮抑制劑和0.02mmol/L低濃度一氧化氮4d時的發(fā)病率和病斑面積分別是對照的80.0%、73.3%、40.0%和72.3%、36.9%、24.9%，高濃度一氧化氮處理誘導抵抗病原菌侵染的能力明顯低于其他兩組。

2.2 不同濃度一氧化氮處理后的NO水平

圖2 不同濃度一氧化氮處理對采后番茄果實內(nèi)源一氧化氮水平的影響Fig.2 Effect of the concentration of nitric oxide on NO level of tomato fruits

不同濃度一氧化氮處理之后對采后番茄果實NO水平的影響依賴于硝普鈉(SNP)的處理濃度，0.5mmol/L SNP處理在24h內(nèi)能顯著提高番茄果實的內(nèi)源NO水平，24h之后急劇下降，但是仍高于其他3組處理。低濃度0.02mmol/L SNP處理后的NO水平略高于對照，NO抑制劑L-NNA處理能夠抑制番茄果實內(nèi)源NO水平，2d后3組處理趨于一致。

2.3 不同濃度一氧化氮對茉莉酸含量和脂氧合酶活性的影響

圖3 不同濃度一氧化氮處理對采后番茄果實茉莉酸類物質(zhì)含量及脂氧合酶活性的影響Fig.3 Effect of the concentration of nitric oxide on jasmonates content and lipoxygenase activity of tomato fruits

從圖3可以看到低濃度0.02mmol/L SNP處理能夠明顯誘導JAs含量和LOX活性的增加，高濃度0.5mmol SNP處理反而對此起到了抑制作用，雖然0.5mmol/L SNP處理12h后LOX活性有所上升，但是對之前的抑制作用補償效果并不顯著。NO抑制劑L-NNA處理20h內(nèi)LOX活性都高于其他3組，活性增加在6h開始下降；與此對應，L-NNA處理后12h JAs含量表現(xiàn)出下降趨勢。

2.4 不同濃度一氧化氮對苯丙氨酸解氨酶活性的影響

在植物的抗病反應中，苯丙烷類代謝是一條產(chǎn)生酚類物質(zhì)、植保素和木質(zhì)素等重要抗菌物質(zhì)的途徑。苯丙氨酸解氨酶(phenylalnine ammonialyase，PAL)是該代謝途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶，因此，PAL活性的高低與植物的抗性強弱有直接關(guān)系，可作為植物抗病性強弱的生化指標之一[14]。從圖4可以看出，與前面結(jié)果保持一致的是低濃度0.02mmol/L SNP 處理能夠顯著誘導PAL活性的增加，高濃度0.5mmol/L SNP 處理也能誘導PAL活性的增加，但其誘導程度明顯不如前者。L-NNA 對PAL 的誘導作用與對JAs 含量和LOX 活性的影響表現(xiàn)出一致性，呈現(xiàn)先增后減的趨勢，在6h時達到高峰，隨后開始下降，在后期一直低于對照。

圖4 不同濃度一氧化氮處理對采后番茄果實苯丙氨酸解氨酶活性的影響Fig.4 Effect of the concentration of nitric oxide on phenylalnine ammonialyase activity of tomato fruits

3 討論與結(jié)論

近年來果蔬產(chǎn)品采后抗性誘導成為研究的熱點，被認為是最有前途的控制采后病害的新途徑。NO作為一種廣泛存在于植物體內(nèi)的信號分子在植物的抗病反應中起到重要的作用[15]。本實驗中不同濃度一氧化氮處理均能提高番茄果實抵抗灰霉病原菌Botrytis cinereaPers.侵染的能力，這與McDoell等[16]結(jié)果是一致的，他們認為NO在植物抵抗病原菌侵染方面起到了重要甚至是不可替代的作用。從不同濃度一氧化氮處理的結(jié)果中我們可以看出，低濃度處理(0.02mmol/L)能顯著抑制接種后灰霉病原菌Botrytis cinereaPers. 的繁殖與生長，減少病斑面積的擴大，高濃度SNP處理(0.5mmol/L)雖然也能起到一定的抑制作用，但抑制病原菌生長的能力明顯不及0.02mmol/L SNP和0.5mmol/LL-NNA處理，令人疑惑的是NO抑制劑L-NNA處理后番茄果實抵抗病原菌侵染的能力也有增強，且增強作用高于高濃度0.5mmol/L SNP處理，這可能與其他信號途徑的代償有關(guān)。

茉莉酸也是在植物抵抗病原菌侵染方面發(fā)揮重要作用的一種信號分子[17]。Chehab等[18]指出茉莉酸類物質(zhì)是植物激活直接防御機制不可或缺的一類代謝物質(zhì)，Yu等的實驗[19]也證明茉莉酸甲酯能夠降低灰霉病原菌侵染番茄果實的病害特征。本實驗結(jié)果表明，低濃度SNP處理(0.02mmol/L)能夠顯著誘導JAs合成關(guān)鍵酶LOX活性的增加，影響JAs含量的變化，而高濃度SNP處理(0.5mmol/L)則對JAs合成起到了抑制作用，說明了茉莉酸參與了一氧化氮所誘導的抗性誘導過程。一氧化氮抑制劑L-NNA處理導致JAs含量和LOX活性出現(xiàn)先增后減的趨勢，在PAL活性的檢測上也出現(xiàn)類似的現(xiàn)象，更加有力地說明了JAs在NO誘導番茄果實抗病性這一過程中的作用是不可忽略的。

根據(jù)以上結(jié)果，猜測在誘導抗性過程中NO與JA存在一個平衡關(guān)系，NO對JAs合成的影響與濃度效應有關(guān)，即低濃度NO能夠促進JAs合成以及含量的變化，高濃度處理則會起到抑制作用。L-NNA處理后JAs含量和LOX活性先增后減可以解釋為處理短時間內(nèi)番茄果實中NO含量匱乏，誘導JAs合成，導致JAs含量在短時間內(nèi)快速增加，但是體內(nèi)NO和JA平衡的破壞導致這種快速增加現(xiàn)象并不能長久維持，因而在后期表現(xiàn)出下降趨勢，而在這一過程中抗病能力的增強則可能是JAs發(fā)揮作用的結(jié)果。但是必須指出的是，本實驗僅僅只是證明了JAs參與了NO誘導抗病性這一過程，具體的調(diào)控過程還需要進一步的驗證。一些文獻表明JAs也可以誘導抗病性[20-21]，那么在JAs參與NO誘導采后番茄果實抗病性過程中，抗病性的增強是因為NO與JA對抗病能力的協(xié)同誘導，還是存在一個上下游關(guān)系，這都是需要今后進一步證明的問題。

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Effect of Postharvest Nitric oxide Treatment on Jasmonates Biosynthesis and Disease Incidence toBotrytis cinereaPers. in Tomato Fruits

LIU Ling-yi1，YU Meng-meng1，ZHENG Yang1，SHENG Ji-ping1，SHEN Lin1,2,*
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China；
2. College of Food Science and Pharmaceutical Science, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China)

Nitric oxide (NO) and jasmonates (JAs) are important signaling molecules in plant disease resistance. Recent studies have shown the evidences about NO cross talks with jasmonic aicd (JA) pathway. In order to find the relationship between NO and JAs during disease resistance induction, tomato fruits (Lycopersicon esculentumcv. No.4 Zhongshu) were treated with different concentration of NO, then measured the effects on resistance toBotrytis cinereaPers., NO level, JAs content, the key enzyme activity of JA biosynthesis and phenylalnine ammonialyase activity which is related to disease resistance. Our results showed that treatment with NO could induce disease resistance at all NO levels tested, however, the most obvious induction symptom was recorded in low concentration (0.02 mmol/L). Low concentration treatment increased JAs contents and the key enzyme activity of JA biosynthesis, while inhibited in high concentration treatment.

tomato fruits；nitric oxide；jasmonates；disease resistance

TS255.3

A

1002-6630(2010)22-0457-05

2010-05-12

國家自然科學基金項目(30671471；30972065；31071623)：“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAD22B07)；

國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科技專項(200803033)

劉零怡(1987—)，女，碩士研究生，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏技術(shù)研究。E-mail：liulingyi607@yahoo.com.cn

*通信作者：申琳(1964—)，男，副教授，博士，主要從事果蔬采后生理與生物技術(shù)研究。E-mail：pingshen@cau.edu.cn