響應面分析法優化HS-SPME萃取黃豆醬揮發性成分工藝研究

喬 鑫，黃紅霞，喬 宇，康 旭，李冬生,2,*

(1.湖北工業大學生物工程學院，湖北 武漢 430068；2.湖北省食品發酵工程技術研究中心，湖北 武漢 430068；3.湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所，湖北 武漢 430064)

響應面分析法優化HS-SPME萃取黃豆醬揮發性成分工藝研究

喬 鑫1，黃紅霞1，喬 宇3，康 旭1，李冬生1,2,*

(1.湖北工業大學生物工程學院，湖北 武漢 430068；2.湖北省食品發酵工程技術研究中心，湖北 武漢 430068；3.湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所，湖北 武漢 430064)

為了優化黃豆醬揮發性風味成分檢測的SPME萃取效率，采用Plackett-Burman設計法和響應面分析法對黃豆醬風味萃取條件進行優化。先用Plackett-Burman設計從8種萃取因素中篩選出對總峰面積有顯著影響的因素，再用最陡爬坡試驗及Box-Behnken設計進一步優化。結果表明，萃取溫度、萃取時間和基體中的無機鹽添加量是影響總峰面積的顯著因素，優化后的萃取條件為萃取溫度56℃、萃取時間42min、基體中的無機鹽添加量0.98g。在優化條件下，與初始最大總峰面積12880000相比，總峰面積提高到13107129。

豆醬；響應面法；條件優化；HS-SPME

Abstract：In order to enhance the extraction efficiency of soybean paste flavor components, Plaekett-Burman design and response surface methodology were used to optimize extraction conditions. Eight factors were evaluated by Plackett-Burman design on the basis of total peak area and further optimization was performed by Box-Behnken experiments. Results showed that extraction temperature, extraction time and the addition amount of inorganic salts played important roles in the extraction of essential flavor components. The optimal extraction parameters were extraction temperature of 56 ℃, extraction time of 42 min and sodium chloride addition amount of 0.98 g. Under the optimal extraction condition, the total content of volatile flavor components was significantly improved according to the increase of total peak area from 12880000 to13107129.

Key words：soybean paste；response surface methodology；technology optimization；HS-SPME

黃豆醬(soybean paste)在我國有著悠久的歷史，是人民生活中不可缺少的調味品，風味又是調味品至關重要的品質特性，對其研究有著必要的意義[1]。但目前存在的主要問題之一是揮發性成分提取手段有局限性，很難真實反映產品氣味組成。近幾年頂空固相微萃取(HSSPME)作為一種新的揮發性物質采樣技術被廣泛應用，它通過吸附/脫附技術，主要富集樣品中的揮發和半揮發性成分，靈敏度高、重現性及線性好、操作簡單方便快速并能較真實地反映樣品特別是活體樣品的風味組成[2-3]。Gianelli等[4]和徐琳娜等[5]對黃豆醬香氣成分的萃取做過研究，但黃豆醬萃取工藝的優化研究還未見報道。基于此，本研究采用頂空固相微萃取并結合響應面法優化萃取條件，以提高黃豆醬香氣的萃取效率。

東北豆醬不僅在原料上為當地精選品種，而且醬香濃郁。本研究以東北知名醬業生產的優質豆醬作為研究對象，通過因素篩選，最終選取萃取溫度、萃取時間和基體中的無機鹽添加量3個因素進行響應面設計，利用響應面法優化黃豆醬香氣的最佳萃取工藝參數，以期為黃豆醬香氣成分研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑龍江省某知名醬業公司生產，樣品保存于密封袋中，4℃冷藏備用。

1.2 儀器與設備

固相微萃取(SPME)裝置：萃取頭DVB/CAR/PDMS 50/30μm(二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷) 美國Supelco公司；GC-2014AFSPL氣相色譜儀 日本島津公司；7890N/5975MSD風味檢測氣質聯用儀 美國Agilent公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長城科工貿有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃豆醬揮發性成分的測定

稱取一定量醬醅，并與一定量無機鹽(NaC1)和一定去離子水體積混合均勻后加入15mL樣品瓶中，將樣品瓶放入一定溫度的水浴中平衡5min，再將已老化好的萃取針頭插入樣品瓶中，用手柄將石英纖維頭推出暴露到樣品瓶頂空氣體中，恒溫萃取一段時間，用手柄將纖維頭推回針頭內，將萃取針頭拔出，插入GC-MS進樣器中解析一定時間。

1.3.2 萃取頭老化

將DVB/CAR/PDMS 50/30μm固相微萃頭在氣相色譜的進樣口老化至無雜峰，老化溫度270℃，老化時間1h[6]。

1.3.3 GC-MS參數條件

色譜柱：RTX-1毛細管色譜柱(30.0m×0.25mm，0.25μm)；升溫條件：柱溫40℃保持1min，以5℃/min上升到130℃，保持1min，再以8℃/min上升到250℃，保持1min；進樣口溫度為250℃；FID檢測器溫度為300℃；載氣N2，流速30mL/min；燃氣H2，流速300mL/min；助燃氣空氣，流速400mL/min；分流比5.0。

1.4 優化試驗設計

1.4.1 Plackett-Burman

設計在優化初期利用Plackett-Burman設計法[7]，對影響固相微萃取的8個因素進行考察。萃取溫度(X1)、萃取時間(X2)、解析時間(X3)、攪拌速度(X4)、樣品質量(X5)、去離子水體積(X6)、基體中的無機鹽添加量(X7)、pH值(X8)，分別作為PB試驗設計的8個因素，每個因素取兩個水平，即低水平(－1)和高水平(+1)，總峰面積作為響應值Y[8]。

1.4.2 最陡爬坡試驗

響應面擬合方程只有在考察的緊接鄰域里才充分近似真實結果，故只有先逼近最大目標產物產量區域后才能建立有效的響應面擬合方程[9]。根據PB試驗篩選出的對峰面積影響顯著的因素，以各顯著因素的正負效應確定最陡爬坡試驗的路徑(包括變化方向和變化步長)，快速的逼近最大響應區域。

1.4.3 Box-Behnken設計

以PB試驗篩選得到的對總峰面積影響顯著的因素作為設計因素，以最陡爬坡試驗得出的濃度作為中心點，根據相應的試驗表進行試驗后，使用SAS 9.0對試驗結果進行響應面分析[10]。

2 結果與分析

2.1 影響因素的篩選

按照Plackett-Burman試驗設計，對影響固相微萃取萃取條件的8個因素進行考察，Plackett-Burman試驗設計[8]及結果見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 1 Design and results of Plackett-Burman experiments

表2 Plackett-Burman試驗設計各因素水平編碼及影響效果Table 2 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

2.2 最陡爬坡試驗

由2.1節可知，萃取溫度有高度顯著影響；萃取時間有顯著影響；基體中無機鹽添加量、解析時間、攪拌速度、樣品質量、去離子水體積、pH值對總峰面積均無顯著影響，但一般可信度大于90%可作為主要影響因素[11]，基體中無機鹽添加量屬主要影響因素。萃取溫度和萃取時間對總峰面積有顯著正效應，而基體中的無機鹽添加量有顯著負效應，這3個因素有待進一步研究。根據萃取溫度、萃取時間和基體中無機鹽添加量這3個因素效應大小的比率設定它們的變化方向及步長進行最陡爬坡試驗，設計及結果處理見表3。由表3可知，隨萃取溫度、萃取時間、基體中無機鹽添加量的變化，總峰面積呈先上升后下降，當萃取溫度55℃、萃取時間40min、基體中的無機鹽添加量0.8g時，所對應的總峰面積達到最大值，故以條件3為后續實驗中心點，進行下一步優化試驗。

表3 最陡爬坡試驗設計及結果Table 3 Design and results of the steepest ascent experiments

2.3 最佳萃取條件的優化[12-14]

2.3.1 響應面分析因素水平的選取

在最陡爬坡試驗的基礎上，采用響應面設計，運用Box-Behnken中心組合試驗設計原理[15]，選擇黃豆醬揮發性風味物質提取條件對總峰面積影響顯著的3個因素，萃取溫度(X1)、萃取時間(X2)和基體中無機鹽添加量(X3)，做三因素三水平響應面分析試驗，試驗因素與水平設計見表4。

表4 響應面分析因素及水平Table 4 Factors and levels of response surface design

2.3.2 響應面優化方案

表5為響應面分析方案及實驗結果，試驗號1～12是析因試驗，試驗號13～15是中心試驗。15個試驗點分為析因點和零點，其中析因點為自變量取值在X1、X2、X3所構成的三維頂點；零點為區域的中心點，零點試驗重復3次，用以估計試驗誤差。RSM軟件對所得數據進行回歸分析，回歸分析結果見表6。

表5 響應面試驗設計及相應結果Table 5 Design and results of response surface experiments

表6 回歸方程方差分析Table 6 Variance analysis of regression equation

2.3.3 因素間的交互作用分析

圖1結果顯示了基體中的無機鹽添加量取中心水平時，萃取溫度和萃取時間對總峰面積的交互作用。從等高線圖接近圓形可知交互作用不顯著，隨著萃取溫度延長和萃取時間的增加，總峰面積在不斷的增大，當萃取溫度和萃取時間升高到一定程度后，響應值值達到最大；萃取溫度和萃取時間繼續升高時，總峰面積又會隨之下降。說明萃取溫度過高或過低和萃取時間過大或過小都不能使響應值達到最大值，只有它們取到某個適中值時，才可使總峰面積達到最大值。

圖1 萃取溫度(X1)和萃取時間(X2)對總峰面積(Y)的相應面圖和等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between extraction temperature and extraction time on total content of volatile flavor compounds

圖2 萃取溫度(X1)和無機鹽添加量(X3)對總峰面積(Y)的相應面圖和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between extraction temperature and inorganic salt addition amount on total content of volatile flavor compounds

圖2結果顯示了萃取時間取中心水平時，萃取溫度和基體中的無機鹽添加量對總峰面積的交互作用。從等高線圖接近橢圓形可知交互作用顯著，在試驗水平范圍內總峰面積隨萃取溫度的增加呈現出先增加后略減小的趨勢。原因可能是溫度過低，未達到豆醬部分風味物質的沸點，高沸點的風味物質無法揮發出來，總峰面積相對較少；隨溫度升高，萃取頭萃取分析能力降低，從而導致萃取頭固有吸附組分會發生解吸[17]，總峰面積發生減少現象。

圖3 萃取時間(X2)和無機鹽添加量(X3)對總峰面積(Y)的相應面圖和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between extraction time and inorganic salt addition amount on total content of volatile flavor compounds

圖3結果顯示了萃取溫度取中心水平時，萃取時間和基體中的無機鹽添加量對總峰面積的交互作用。從等高線圖接近橢圓形可知交互作用顯著，萃取時間影響顯著，在試驗水平范圍內，萃取時間的增加總峰面積呈明顯的先增加后略減小的趨勢。而基體中的無機鹽添加量的增大，總峰面積緩慢增大后基本保持不變。原因可能是無機鹽添加量增加有利于豆醬樣品中風味物質的揮發，但到達一定程度后，豆醬樣品中無機鹽處于飽和狀態[12]，于是總峰面積基本保持恒定。

2.4 豆醬揮發性風味物質萃取回歸模型的建立及檢驗

對各因素回歸擬合后，得到回歸方程：

所得的回歸方程能較好的預測豆醬揮發性風味物質萃取隨各參數的變化規律，可以利用該回歸方程確定最佳提取條件。對回歸方程取一階偏導數等于零，聯立方程組解得：X1=0.14，X2=0.18，X3=1.8，即可換算得到萃取溫度55.75℃、萃取時間41.8min、基體中的無機鹽添加量0.98g。考慮到實際操作的便利，確定豆醬揮發性風味物質萃取條件為萃取溫度56℃、萃取時間42min、基體中的無機鹽添加量0.98g。由回歸方程預測豆醬揮發性風味物質萃取條件理論總峰面積可達13107129。

表7 豆醬中鑒定出的揮發性化合物Table 7 Identified volatile flavor compounds in soybean paste

驗證實驗：在上述響應面分析結果確定的最佳條件下進行3次萃取實驗，得到豆醬揮發性風味物質的平均總峰面積為13001025，與預測值13107129基本一致，說明該方程與實際情況擬合很好，充分驗證了所建模型的正確性，說明響應面法適用于對豆醬揮發性風味物質萃取進行回歸分析和參數優化。

2.5 醬樣品中揮發性風味成分的分析檢驗

采用優化后的固相微萃取條件并結合氣質聯用測定了豆醬樣品中的揮發性風味成分。豆醬樣品中各揮發性風味成分的種類及相對含量見表7。

根據表7，豆醬樣品中共鑒定出36種揮發性風味成分，這些成分包括酯類、醛類、酸類、醇類、酮類、酚類和含氮化合物等幾類物質，可見此優化方法能較完全地萃取豆醬樣品中的揮發性風味成分。從單個風味化合物檢出頻次看，典型風味化合物苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、棕櫚酸甲酯、安息香醛、風信子醛[18]和4-乙基愈創木酚[6]均被檢測到，且檢測量較高。

酯類易揮發，人嗅覺對此類物質也比較敏感，因而酯類是發酵食品風味的重要組分；本優化方法共檢出9種酯類，且這些酯類物質的氣味強度適中，溫和厚重，是豆醬香味的底蘊。醛類物質的閾值一般較低，對食品整體風味的貢獻較大；檢出的7種風味化合物無論種類還是總相對含量均較高。醇類化合物的風味閾值較高，對整體風味貢獻較小，此方法僅檢測出苯乙醇。酚類及含氮化合物由于其風味閾值很低，對黃豆醬的整體風味貢獻很大，兩類物質各檢出5種風味物質。酸類、酮類及烷烴類為“風味物質前體庫”，在后熟期間再經一系列復雜的發酵代謝和生化反應，這三類物質檢出種類相對不多。該優化方法簡便、快速、經濟安全、無溶劑、選擇性好且靈敏度高，集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體，大大加快了分析檢測的速度，對大分子物質的吸附能力較強，能較好地體現出黃豆醬本身的風味特征，適于分析黃豆醬風味物質的組成。

3 結 論

實驗證明響應面方法對豆醬揮發性風味物質萃取是非常有效的工具，Plackett-Burman試驗設計能對影響總峰面積的各因素效應進行評價并能有效地找出主要因素，最陡爬坡法能充分接近最大響應面區域，B o x-Behnken試驗設計能建立主要因素影響總峰面積的二次多項數學模型，并利用統計學方法對該模型進行了顯著性檢驗，優化了內在因素水平，找出最佳值。該研究經響應面方法優化，得出豆醬揮發性風味物質萃取的最佳工藝條件為萃取溫度56℃、萃取時間42min、基體中的無機鹽添加量0.98g。在優化條件下經3次萃取實驗驗證，預測值與驗證實驗平均值接近，與初始最大總峰面積12880000相比，總峰面積有所提高，達到13107129；且優化方法能較好地體現出黃豆醬本身的風味特征，適于分析黃豆醬風味物質的組成。

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Optimization of HS-SPME Extraction for Volatile Flavor Compounds from Soybean Paste by Response Surface Methodology

QIAO Xin1，HUANG Hong-xia1，QIAO Yu3，KANG Xu1，LI Dong-sheng1,2,*
(1. College of Bioengineering, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China；2. Food Fermentation Engineering and Technology Research Center of Hubei, Wuhan 430068, China；3. Institute of Agricultural Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430064, China)

TS207.3

A

1002-6630(2010)22-0069-06

2010-07-23

湖北省科技廳重大攻關項目(鄂財企發[2007]119號)

喬鑫(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：qiaoxinspring@163.com

*通信作者：李冬生(1961—)，男，教授，碩士，研究方向為食品生物技術。E-mail：dongshengli86@163.com