轉錄組平臺技術及其在代謝工程中的應用

史碩博，陳濤，趙學明

1 天津大學 系統生物工程教育部重點實驗室，天津 300072

2 愛丁堡大學-天津大學系統生物學與合成生物學聯合研究中心，天津 300072

代謝工程

轉錄組平臺技術及其在代謝工程中的應用

史碩博1,2，陳濤1,2，趙學明1,2

1 天津大學 系統生物工程教育部重點實驗室，天津 300072

2 愛丁堡大學-天津大學系統生物學與合成生物學聯合研究中心，天津 300072

組學技術在系統水平上對細胞代謝進行全面的分析，極大地促進了代謝工程的發展和應用。全基因組水平的轉錄分析可以使研究者更加精確地評估細胞表型，加深對細胞代謝的理解。而且轉錄組分析也有助于研究者鑒定菌種改良的目標基因，加速對微生物細胞工廠的合理設計及構建。文中介紹了 3種主要轉錄組平臺技術的原理，并總結了轉錄組學在代謝工程領域中應用的最新進展和未來發展趨勢。

轉錄組，代謝工程，基因芯片，serial analysis of gene expression (SAGE)，massively parallel signature sequencing(MPSS)，RNA-seq

Abstract:Omics technologies have profoundly promoted development and applications of metabolic engineering by analysis of cell metabolism at a system level. Whole genome transcription profiles have provided researchers more rigorous evaluation of cell phenotype and an increased understanding of cellular metabolism. Furthermore, transcriptome analysis can conduce to identification of effective gene targets for strain improvement, and consequently accelerates rational design and construction of microbial cell factories for desired product. In this review, we briefly introduced the principle of three main platforms of transcriptome, and reviewed the recent applications of the transcriptome to metabolic engineering, finally provided conclusions and future prospects.

Keywords:transcriptome, metabolic engineering, microarray, SAGE, MPSS, RNA-seq

近年來，包括基因組、轉錄組、蛋白質組、代謝組和代謝通量組的各種組學技術在揭示細胞生理活動規律的研究中起著越來越重要的作用[1-2]。通過組學技術，可以系統評價細胞表型，并根據評價結果進一步設計、修飾和重構細胞，提升代謝工程的合理性和有效性[3-4]，這就是在后基因組時代所強調采取組學技術指導的代謝工程研究方法，稱之為“系統代謝工程”[5]。

在各種組學技術中，轉錄組學是率先發展起來以及應用最廣泛的技術[6]。細胞的功能是從基因的表達開始的，轉錄組是指某一時間細胞內所有基因轉錄而來的RNA總稱。通過分析轉錄組，可高通量地獲得基因表達的RNA水平有關信息，可以揭示基因表達與一些生命現象之間的內在聯系。據此我們可以高通量表征細胞生理活動規律，確定細胞代謝特性，并進而對細胞進行修飾改造[7-8]。本文介紹了轉錄組學主要技術平臺及其原理，總結和評述了轉錄組學在代謝工程中的應用及進展。

1 轉錄組技術平臺

為了高通量并行分析基因的表達情況，各種轉錄組技術平臺得到迅速發展，主要包括：基因芯片技術 (Microarray)、基因表達系列分析技術 (Serial analysis of gene expression，SAGE)、大規模平行測序技術 (Massively parallel signature sequencing，MPSS)以及最新提出的 RNA測序技術 (RNA sequencing，RNA-seq)，這些技術的工作流程如圖1所示。

圖1 主要轉錄組技術平臺工作流程示意圖Fig.1 Outline protocols of the main transcriptome platforms.

1.1 基因芯片技術 (Microarray)

在轉錄組研究中應用最早及最廣泛的為基因芯片技術，首先從待檢測樣品中提取RNA，并利用熒光標記的核苷酸將其反轉錄成 cDNA，經過標記的核苷酸序列可與基因芯片特定位點上的探針雜交，經檢測雜交信號而獲取細胞基因表達信息。基因芯片技術已成為一項非常穩定可信的實驗技術，目前公布的大量轉錄組數據主要是利用基因芯片技術產生的。

為了促進基因芯片數據的交流和比較，2001年基因芯片表達數據協會 (Microarray gene expression data society) 提出了基因芯片試驗的標準方案，即MIAME方案 (Minimal information about a microarray experiment)[9]；由美國食品藥物管理局 (US food and drug administration，FDA) 領導實施的基因芯片質量控制聯盟 (MAQC) 發表的報告顯示在不同實驗室之間基因芯片技術平臺內部的數據具有高度的一致性和重現性[10]?；蛐酒亲钤玳_發出來的高通量轉錄組檢測技術，且成本適中，其對較高表達的基因檢測比較準確，數據分析軟件較多，整個方法較為成熟，主要缺點是對低表達基因檢測敏感度不夠，前期工作基礎要求較高，而且很難檢測出融合基因轉錄、多順反子轉錄等異常轉錄產物。

1.2 基因表達系列分析技術 (SAGE) 與大規模平行測序技術 (MPSS)

SAGE技術是一種基于測序技術、開放式的、快速高效的分析細胞基因表達狀態的方法，該技術不需任何基因序列的信息，能夠全局性地檢測所有基因的表達水平，除了具有顯示基因差異表達譜的作用外，還對于那些未知基因特別是那些低拷貝基因的發現起到了巨大的推動作用[11]。SAGE技術首先從待檢測樣品中提取RNA，并用生物素熒光標記的核苷酸將其反轉錄成 cDNA，隨后用一種被稱為錨定酶的限制性內切酶 (Anchoring enzyme) 切割雙鏈cDNA，將回收得到的cDNA片段與不同的接頭連接，再用標簽酶酶切處理后得到SAGE標簽，連接SAGE標簽形成標簽二聚體并進行PCR擴增，最后錨定酶切除接頭序列以形成標簽二聚體的多聚體，對其測序可得轉錄組。

MPSS技術是對 SAGE技術的改進，但其原理都是基于短標簽測序 (Tag-based sequencing) 的方法。MPSS技術可獲得更長的短標簽，因而精度更高；此外，MPSS技術特有的微球熒光測序可直接高通量讀出序列，簡化了測序過程[12]。MPSS技術首先從待檢測樣品提取RNA并反轉錄為cDNA，克隆至帶有不同adaptor的載體文庫中，隨后PCR擴增帶有不同adaptor的cDNA片段，在T4 DNA聚合酶和 dGTP的作用下使其轉換為單鏈文庫，最后通過雜交將其結合在帶有 Anti-adaptor的微載體上進行測序。

SAGE技術和 MPSS技術都需要大量的測序工作，但高通量基因測序儀的迅速發展緩解了這一問題，有力推動了它們的推廣與應用。但是這些技術的難度較大，而且涉及酶切、PCR擴增、克隆等可能會產生堿基偏向性的操作步驟，從而影響轉錄本的正確識別[12]。Illumina公司于2007年在MPSS技術的基礎上推出新一代測序儀 Illumina/Solexa Genome Analyzer，正迅速得到普及。

1.3 RNA測序技術 (RNA-seq)

新一代高通量基因組測序儀的迅速發展(Solexa，454 GS-FLX，SOLiD，tSMS) 不僅給基因組領域帶來革命性的突破，同時也給轉錄組檢測方法帶來重大革新。采用類似SAGE技術和MPSS技術的理念，新一代高通量基因組測序儀可以通過測定細胞全部轉錄產物序列，通過序列比對得到最后的轉錄組，一個新的測定轉錄組的“RNA測序”法出現了，該技術稱為RNA測序技術 (RNA-seq)[13-14]。

RNA測序技術的原理與SAGE技術和MPSS技術一致，即對細胞轉錄產物進行測序，統計測得的每條序列獲得每個特定轉錄本的表達量，可提供精確的數字化表達譜檢測。該技術首先將細胞中的所有轉錄產物反轉錄為cDNA文庫，然后將cDNA文庫中的 DNA隨機剪切為小片段(片段大小根據采取的測序方法的讀長而不同)，利用新一代高通量測序儀測序直到獲得足夠的序列。高通量測序避免了亞克隆過程中引入的偏差，且其確定的短序列長度顯著增加。獲得長度顯著增加的短序列所包含信息可以提高識別其對應的基因的準確性，然后計算這些短序列的個數和分析其在整個基因組中的分布，可以計算出細胞的轉錄組表達水平[14]。

RNA-seq技術可以提供更多信息，可以得到用基因芯片難以得到的轉錄可變剪接序列[14]；該技術對低表達基因的檢測更加準確，并且可以定量確定轉錄水平。核苷酸多態性、GC偏向會影響 SAGE和MPSS測定轉錄組時的精確性，而RNA-seq技術克服了這些不足。RNA-seq技術得到的標簽長度(由采取的高通量測序技術的讀長而定，可達400 bp)比SAGE和MPSS顯著增加，提高了識別轉錄本的特異性和準確性[15]。

RNA測序技術目前發展很快，在轉錄組研究中迅速得到廣泛應用，受到高度好評。由于RNA測序技術產生海量的數據，面臨著一系列新的信息學方面的難題，其中包括如何最好地詮釋和比對鑒定多個類似的同源基因；如何確定最佳測序量，獲得高質量的轉錄圖譜等[16]。

1.4 轉錄組技術平臺比較

目前應用在轉錄組研究中的幾種高通量基因表達分析技術各有特點 (表 1)，這些技術在應用的某些方面存在重疊和競爭，RNA測序技術具有的優勢較多，然而就目前來說，這些技術在更多方面體現的是優勢互補、數據互補，不同方法協同配合使用，可以互相彌補各自的遺漏部分，將提供以前的單種技術難以提供的更加全面的轉錄組分析[17-19]。例如，對同樣的樣品，分別采用基因芯片和RNA測序技術產生的轉錄組數據其相關性只有 0.45[20]，分別采用基因芯片和SAGE技術產生的轉錄組數據也存在類似的相關性[21]。這些數據差異主要是由不同技術的原理特性造成的，每種技術都會丟失部分信息，并不是僅僅由于檢測靈敏性造成的[18,22]。

表1 幾種高通量基因表達分析技術的比較Table 1 Comparison of methods used in global analysis of gene expression of organism

2 轉錄組在代謝工程領域的應用

全基因組水平的轉錄分析可以使研究者更加精確地評估細胞表型與基因表達的關系，加深對細胞代謝的理解，而且轉錄組分析也有助于研究者鑒定菌種改良的目標基因，加速對微生物細胞工廠的合理設計及構建。目前轉錄組在代謝工程領域的應用正快速得到普及和發展。

2.1 微生物細胞特性的改造

2.1.1優化菌種耐受性及減少代謝副產物合成

微生物在發酵生產過程中必然會遭受一些抑制細胞正常生長及產物合成的不利環境因素，細胞對不利環境的耐受性是一種非常復雜的表型，通過對不同環境中生長的菌株的轉錄組比較，往往可以發現那些和表型密切相關的基因，從而使研究者可以更好地通過代謝工程來增強菌種對不利環境的耐受性。Hirasawa等[23]比較了兩株具有不同的乙醇耐受性的S. cerevisiae轉錄組差異，利用聚類分析方法發現色氨酸合成基因的表達水平與乙醇耐受性緊密關系。過量表達色氨酸合成基因可以使乙醇耐受性低的菌株對5% (V/V)的乙醇具有耐受性，而且外源添加色氨酸并同時增強表達色氨酸透性酶同樣可以增加對乙醇的耐受性。Hirasawa等[24]還通過分析高鹽條件下兩株不同滲透壓耐受性S. cerevisiae的轉錄組，發現鈉離子泵與銅金屬硫蛋白基因與菌體滲透壓耐性密切相關，提高上述基因的表達水平可顯著提高菌株的滲透壓耐性。Veit等[25]通過對E. coli轉錄組的分析發現sdhCDAB、sucB、sucC、acnB、lpdA、fumC、mdh等基因以及acs-yjcH-actP操縱子的表達與乙酸形成負相關，增強sdhCDAB-b0725-sucABCD系列基因表達顯著降低乙酸的形成，同時不影響菌株的生長速率。由于E. coli的生長主要受到其自身分泌的乙酸的抑制，而采取直接阻斷乙酸合成途徑的策略會顯著降低菌體的生長速率，上述研究結果無疑是一種更好的替代策略。

2.1.2擴大底物利用范圍

擴大菌株的底物利用范圍對于利用生物質資源生產生物基化學品具有重要的意義，一些微生物對木糖、半乳糖等底物快速利用的表型 (尤其是在厭氧條件下) 也涉及到復雜的基因表達變化。Bro等[26]利用轉錄組分析了具有不同半乳糖攝取速率的S. cerevisiae菌株，鑒定出編碼葡糖磷酸變位酶的PGM2基因為新的靶標，通過增強該基因的表達使工程菌半乳糖攝取速率提高了70%，該研究還表明如果對底物消耗速度不同的多株菌株同時進行轉錄組分析，則獲得有用信息的效率將大為提高。Guimaraes等[27]比較了一株由進化工程獲得的可快速利用乳糖的S. cerevisiae突變株與野生株的轉錄組差異，大部分差異表達基因的功能集中在與RNA介導的轉座、DNA修復與重組、抗逆性、染色體重建、細胞周期控制、有絲分裂調控，少部分差異表達基因與糖酵解和乙醇發酵路徑相關，這些差異表達基因能較好地解釋突變株的表型，為進一步的工程菌的設計提供了基礎。Bengtsson等[28]分析了4株具有不同木糖利用能力的S. cerevisiae與正常菌株的轉錄組差異，發現有13個基因的表達在4個菌株中都發生了變化。在正常菌株中相應過表達或缺失這些差異基因，發現有 5個基因可有效提高菌株對木糖的利用能力，上述研究結果表明轉錄組是對復雜表型進行高效分析的有力工具，其在菌株的代謝工程改造以及通過反向代謝工程重構具有目標表型的菌株中具有不可替代的作用。

2.1.3合成異源蛋白產物

轉錄組指導的代謝工程加速了構建產外源蛋白微生物細胞工廠。例如，Choi等[29]利用基因芯片分析了高細胞濃度下重組E. coli生產類胰島素生長因子I的融合蛋白 (IGF-If) 的轉錄組，發現共有 529個基因的表達水平顯著發生改變。結合已有文獻經分析后增強表達兩個下調基因prsA(編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶，核酸和氨基酸合成的關鍵酶) 和glpF(甘油運輸蛋白，有利于菌體生長)，使 IGF-If的產量由1.8 g/L提高到4.3 g/L。這是一個典型的利用轉錄組數據表征細胞表型并據此分析進而通過遺傳修飾進行菌株改良的例子。Gasser等[30]分析了產人類胰蛋白酶P. pastoris工程菌及野生菌的轉錄組差異，共有 524個基因表達水平發生明顯改變。分別擴增其中13個與蛋白分泌、應激反應相關的上調表達基因，發現新確定的6個基因Bfr2、Bmh2、Ssa4、Sse1、Cup5、Kin2明顯提高人類胰蛋白酶的比生產速率，并增加了蛋白總產量。由于蛋白質的合成分為設計剪切、折疊、分泌等多個步驟，傳統代謝靶標分析方法在這里受到很大的局限，包括轉錄組在內的組學技術可深入對菌體代謝理解，對增強蛋白質合成能力提供重要的信息。

2.1.4提高代謝產物產率和產量

基于轉錄組分析來改良細胞合成目標代謝產物的產率和產量也有大量的應用實例。Lee等[5]分析了E. coli工程菌在過量生產蘇氨酸時菌體轉錄組的變化，發現編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的ppc基因表達水平沒有處于最優狀態。作者增強了ppc基因表達，同時缺失轉錄調節子iclR基因以加強乙醛酸支路通量，新構建的工程菌蘇氨酸產量提高51.4%，作者在這篇文章中率先提出了“系統代謝工程”的概念，強調了組學尺度生理分析對代謝工程的重要意義。Sindelar等[31]通過轉錄組分析確定編碼轉甲基酶的NCgl0855基因，以及編碼銨吸收系統的amtA-ocd-soxA操縱子為影響賴氨酸生產的潛在靶點，增強NCgl0855或amtA-ocd-soxA操縱子的表達，可使賴氨酸產量提高40%。Park等[32]基于產纈氨酸E. coli工程菌與野生菌的轉錄組差異，分別擴增了通用調節子lrp基因以及編碼纈氨酸運輸蛋白的ygaZH基因，纈氨酸產量分別增加了 21.6%和41.7%；共擴增上述基因則使纈氨酸產量可增加113%，作者指出新確定的基因修飾靶點是常規分析方法難以確定的，這充分顯示出轉錄組等系統分析方法的優越性。van den Berg等[33]利用基因芯片技術對P. chrysogenumDS17690的青霉素G高產工程菌與實驗室標準菌株進行轉錄組比較，揭示了以前未知的68個β-內酰胺運輸蛋白，同時通過敲除部分差異表達基因確定了這些基因對產青霉素G的影響，最終獲得幾株產量得到不同程度提高的工程菌株。Harris等[34]構建了一株產頭孢菌素前體物己二酰化-7-氨基甲?；^孢烷酸的工程菌P. chrysogenumDS49834，通過轉錄組分析發現工程菌中頭孢菌素生物合成基因以及引入的外源基因表達水平很高，導致己二?；?7-氨基甲?；^孢烷酸合成過程中消耗了大量的氨甲酰磷酸，造成氨甲酰磷酸的供給不足，由此確定限制目標產物產量提高的代謝靶點為氨甲酰磷酸合成酶。Lum等[35]分析泰樂菌素高產菌株的基因組表達情況發現編碼?；o酶A脫氫酶的aco基因和編碼異丁酰輔酶A變位酶的icmA基因的轉錄水平較野生型菌株有很大提高，增加這兩個基因的拷貝數能為泰樂菌素的生產提供更多的脂肪酸前體。Kang等[36]通過轉錄組分析發現在產阿霉素S. peucetius工程菌中轉錄因子wblA與阿霉素合成負相關。基于此分析，Noh等[37]隨后通過敲除轉錄因子wblA使S. peucetius工程菌抗生素產量提高70%，同時比較了敲除轉錄因子wblA的重組菌與其親株的轉錄組，鑒定出受轉錄因子wblA調控的靶基因。在這些靶基因中選取SCO4967在wblA敲除菌中進一步增強表達水平可提高130%的抗生素產量。Im等[38]分析了不同阿維菌素產量S. avermitilis工程菌株的轉錄組，鑒定出與阿維菌素合成正相關的50個新基因，其中SAV213、SAV3818、 SAV4023等3個基因可促進阿維菌素合成。此外SAV3818基因的增強表達還可促進放線紫紅素的生物合成，表明SAV3818基因為一與抗生素合成相關的重要調控因子[39]。Koetsier等[40]在發酵培養基中添加己二酸，觀察其對Penicillium chrysogenum轉錄組影響，發現aclA基因為表達提高最顯著的基因。缺失aclA基因使菌體己二酸比消耗速率下降32%，aclA基因在E. coli中表達產物可以己二酸為底物，該基因的確定有助于構建頭孢菌素高產菌株。本研究組[41]通過轉錄組分析從基因表達水平上揭示產核黃素工程菌B. subtilisRH33的主要生理特點，發現在產核黃素工程菌中PurR蛋白調控基因表達水平全部降低，而這些基因主要涉及核黃素前體物合成途徑。繼而通過基因修飾，增強工程菌胞內磷酸核糖焦磷酸(PRPP) 濃度，解除PurR蛋白對其調控基因的抑制作用，增加核黃素前體物的供給，從而使核黃素產量提高25%。上述研究工作表明通過轉錄組分析可以發現與表型有關的重要調節子的表達變化，并根據該變化對菌種改造作出相應的合理設計。Hirasawa等[42]研究了產乳酸S. cerevisiae工程菌株的轉錄組，發現有 388個基因表達水平明顯改變，從中選取了 289個基因進行單基因缺失，同時隨機選取56個基因進行單基因缺失。結果表明，只有基于轉錄組結果選取的基因可對乳酸產量發生影響，而隨機選取的基因對菌株乳酸產量基本無作用。Wierckx等[43]通過轉錄組分析指出導致P. putidaS12TPL3高產苯酚的重要原因為酪氨酸合成途徑基因的上調表達以及色氨酸合成途徑基因的下調表達。為了增加胞內酪氨酸濃度，作者敲除了hpd、pobA、phhA、aroP1等 4個基因，然而苯酚的產量反而下降。作者推測P. putidaS12TPL3合成酪氨酸的代謝通路已經處于很好的優化狀態，酪氨酸供給已非限制因素；此時限制苯酚生成的為酪氨酸-苯酚裂解酶，并通過酶活分析以及隨后的通量分析驗證了這一假設[44]，這是一個通過轉錄組分析揭示菌株代謝特征的典型研究實例。

2.2 植物細胞特性的改造

2.2.1提高植物抗逆性

植物的生長發育及產量與外界環境密切相關，通過代謝工程手段可以顯著提高植物對環境脅迫的抗性，保護植物免受外界環境的不良影響。Seki等[45]對擬南芥轉錄組分析，得到了44個受干旱誘導基因以及19個受冷誘導的基因，其中有12個基因被確定為植物脅迫應答的重要調節因子 CBF/DREB(C-repeat-binding-factor/dehydration-responsive-elem ent-binding) 的靶基因。這些靶基因的確認對深入認識植物產生環境脅迫抗性的機理具有重要意義。Benedict等[46]將擬南芥的冷脅迫應答轉錄因子CBF1轉入楊樹，使其冷耐受性明顯增強，同時發現楊樹中受擬南芥CBF1調控的基因與擬南芥中相應基因具有高度一致性。該研究指出 CBF/DREB1冷調控機制可增強植株對多種逆境的抵抗性。類似地，Vogel等[47]發現在低溫環境下擬南芥基因表達水平改變最大的 25個基因受已知的冷脅迫應答途徑的關鍵轉錄因子 CBF/DREB以及新發現的轉錄因子ZAT12調控，通過增加轉錄因子ZAT12的表達，擬南芥可提高其冷耐受性。然而Fowler等[48]通過檢測擬南芥轉錄組發現 CBF/DREB 途徑并不是獲得冷耐受性的唯一途徑，在表達水平發生改變的306個基因中，只有 12%為 CBF/DREB的靶基因。隨后Kim等[49]從這些顯著上調表達的基因中選擇并擴增了兩個編碼DEAD-box RNA解旋酶的基因 (AtRH9和AtRH25)，只有增強AtRH25基因表達水平的轉基因擬南芥提高了對低溫的耐受性。除此之外，Dai等[50]發現在低溫環境下水稻共有328個基因表達水平發生顯著變化，將表達水平增加的基因OsMYB3R-2引入擬南芥能提高轉基因擬南芥對低溫、干旱、高鹽等的耐受性。何飛等[51]分析了不同擬南芥野生居群在冷脅迫處理下轉錄水平的差異，不同擬南芥野生居群在冷脅迫下皆上調基因 (如MAPKs、CBFs、COR等基因) 可能對植物在低溫下生存十分重要。李利華等[52]發現水稻在低磷脅迫后大量基因(1 207個) 在轉錄水平上發生了變化，這些差異表達基因包括了代謝調節離子轉運、信號傳導、轉錄調節、和逆境應答等方面的基因，為提高水稻低磷耐受性提供了有用的信息。

2.2.2提高次級代謝產物產率和產量

植物次級代謝物為醫藥、輕工、化工、食品及農藥等工業的發展提供了豐富的資源，然而其調控是一個十分復雜的系統，造成其產量極低。通過轉錄組分析挖掘次級代謝物合成相關基因，可有力促進相關植物細胞改造。Jennewein等[53]分析了受茉莉酮酸甲酯誘導而處于生產紫杉醇階段的東北紅豆杉基因表達水平，在10 000個cDNA片段中，確定了3 563個基因由茉莉酸甲酯誘導轉錄參與生產紫杉醇。這些基因除了包括已知的紫杉烷代謝所需羥化酶外，還提供了參與紫杉醇合成反應的其他潛在基因，為改良生產菌株提供了有價值的信息。Teoh等[54]在青蒿的轉錄組文庫經序列比對確定一種多功能的P450氧化酶 (由CYP71AV1基因編碼)，并將其在酵母中表達，發現其可以催化FPP環化產物紫穗槐-4,11-二烯 (amorpha-4，11-diene) 到青蒿酸的多步氧化反應，該關鍵基因的確定推動了高產青蒿素工程菌的構建[55-56]。Nagel等[57]在蛇麻腺體(Lupulin glands) 的含有10 581表達序列標簽的基因轉錄文庫中鑒定出 4個編碼 S-腺苷甲硫氨酸-甲基轉移酶(S-adenosyl-L-methionine-dependent O-methyltransferases，OMTs) 的基因，為催化黃腐醇生物合成的關鍵基因，將加速生產植株的構建。Hirai等[58]通過計算數據庫中公開發表的1 388張基因芯片數據的皮爾森相關系數發現，擬南芥中脂肪族芥子油苷生物合成基因與兩個未報道的轉錄因子Myb28(At5g61420) 和Myb29(At5g07690) 相關性很大。通過基因缺失和基因異位表達表明脂肪族芥子油苷生物合成主要受轉錄因子Myb28調控，增強轉錄因子Myb28的表達水平可致使擬南芥合成大量芥子油苷。這些結果表明在轉錄組指導下可高效確定細胞改造策略。

2.3 動物細胞特性的改造

動物細胞系目前已經被廣泛用于蛋白質藥物等產品的大量生產上，利用動物細胞表達蛋白其優勢在于有助于蛋白質正確折疊、組裝并進行翻譯后的修飾，目標蛋白質可正常行使其功能[59]。轉錄組分析在減少細胞代謝負擔、控制細胞貼壁性、調控細胞生長活性等方面都有成功的應用。

Khoo等[60]發現一株具有單抗生產能力的鼠骨髓瘤細胞 (GS-NS0 6A1-100) 與相應野生型 (NS0 WT) 生長代謝速率接近，進而比較了兩株細胞系表達譜差異，推測這些基因表達差異使 GS-NS0 6A1-100細胞可高效利用底物，補償了其合成單抗造成的代謝負擔，使兩株細胞系生長速率類似。Beer等[61]發現小鼠NIH 3T3細胞在32℃可最優生產雙嗜性白血病毒4070A，而當溫度提高到37℃時病毒產量降低。他們通過轉錄組分析發現37℃培養時膽固醇合成與運輸相關基因的表達受到抑制，音猬因子信號通路 (Sonic hedgehog signalling pathway) 相關基因的表達降低。這些溫度誘導的差異表達基因會影響細胞生長代謝和蛋白合成速率，是今后改良細胞工廠的靶標基因。Jaluria等[62]通過聚類分析算法分析非貼壁依賴性與貼壁依賴性 HeLa細胞轉錄組差異，鑒定出siat7e和lama4兩個細胞貼壁性相關基因，降低siat7e基因的表達或提高lama4基因的表達皆可改善 HeLa細胞系的貼壁性。Jaluria等[63]在生長迅速且具非貼壁依賴性 HeLa細胞系的轉錄組中發現兩個上調表達基因 (cdkl3和cox15) 與細胞增殖密切相關，其中cdkl3基因編碼細胞周期依賴性蛋白激酶，cox15基因編碼細胞色素氧化酶亞單位。在 HeLa細胞、人胚腎 293細胞 (Human embryonic kidney-293，HEK-293)、中國倉鼠卵巢細胞 (Chinese hamster ovary，CHO)、犬腎上皮細胞(Madin-darby canine kidney，MDCK) 中，引入并過表達這兩個基因皆可提高細胞增殖速率同時增加了最高活性細胞密度。Wong等[64]通過比較產重組人干擾素γ的中國倉鼠卵巢細胞不同時期的轉錄組差異，發現9個早期細胞凋亡信號基因 (FasL、Fadd、Bim、Bak、Faim、Bad、Bax、Alg-2、Requiem)。Fadd、Faim、Alg-2和Requiem基因在隨后的研究中分別在中國倉鼠卵巢細胞增強或降低其表達水平[65]，這4個相關基因表達水平改變后都提高了細胞凋亡抗性及活性細胞密度，最優的一株重組細胞系重組人干擾素產量提高至原始產量的2.5倍。

3 轉錄組學與其他組學技術的綜合運用

由于細胞內各個層次間的調控互相關聯，單一組學分析具有一定局限性，另外轉錄組分析并不能完全準確地反應細胞內基因的翻譯情況，對于帶有大量突變的突變株，基因序列的突變可能對其轉錄水平沒有影響，但可顯著降低翻譯的效率，這時單純依靠轉錄組分析就會遺漏重要的差異表達信息。因此轉錄組與其他組學技術的整合分析顯得異常重要，各種組學技術的綜合運用有利于重要信息的補充和整合，將加深對復雜生物系統的認識、加速對代謝靶標的識別 (表2)。

表2 多種組學相結合在代謝工程中的應用Table 2 Examples of combined omics guided metabolic engineering

Yoon等[66]研究了處于高菌體濃度狀態下的E. coli的轉錄組與蛋白質組數據，實驗表明在細胞密度增加時表達氨基酸合成的基因受到抑制，直接導致目標重組蛋白產量降低，同時發現伴侶基因(clpB、dnaJK、hslSG、groEL、groES) 的表達也明顯增加，表明菌體處于營養匱乏狀態。Askenazi等[67]利用層次聚類 (Hierarchical clustering) 和主成分分析 (Principle component analysis) 等方法分析了具有不同洛伐他汀產量的Aspergillus terreus菌株轉錄組、代謝物組數據，鑒定出影響產物形成的靶標并對其進行成功改造。Askenazi等研究人員的工作是一個綜合運用組學數據提高微生物生產能力的典型案例。Zamboni等[68]發現高產核黃素工程菌B. subtilisRB50::pRF69不同生長階段產核黃素速率不同，通過研究相應階段的轉錄組和代謝通量組數據，揭示了核黃素生產階段碳代謝流分布，即菌株主要采取非氧化磷酸戊糖途徑獲取核黃素合成前體物，指出了此時限制核黃素生產的代謝瓶頸。Lee等[69]采用轉錄組和蛋白質組技術綜合分析了E. coliW3110及其過量產蘇氨酸突變株 TF5015，發現有54個基因表達水平差異顯著，乙醛酸循環、三羧酸循環以及氨基酸生物合成途徑被激活。通過基因測序，發現蘇氨酸合成基因thrA不僅表達水平提高而且其序列還發生了突變，此外在表達未改變的異亮氨酸合成基因ilvA中也發生了突變，發生的突變有助于解除對蘇氨酸合成路徑的反饋抑制，從而使蘇氨酸過量合成。將發生突變的蘇氨酸合成基因導入E. coliW3110可提高其蘇氨酸產量。Dubouzet等[70]比較了正常日本晴與產色氨酸轉基因日本晴的轉錄組和代謝物組，發現轉基因日本晴中與色氨酸共享莽草酸途徑的苯丙氨酸、酪氨酸的濃度未受影響，其合成途徑的轉錄水平未有明顯改變，說明代謝流未過多進入與色氨酸合成存在競爭的分支代謝途徑。此外轉基因日本晴中，轉化色氨酸的色氨酸脫羧酶酶活較低，有利于色氨酸的累積。鼠骨髓瘤細胞 (NS0) 正常生長通常需要外源添加膽固醇，為了改良培養基而降低成本，Seth等[71]比較了需添加膽固醇的鼠骨髓瘤細胞 (NS0) 與不需添加膽固醇的突變鼠骨髓瘤細胞 (NS0 revertant) 轉錄組與蛋白質組差異，結果表明表達降低的Hsd17b7基因導致膽固醇營養缺陷型，并通過實驗驗證[72]。Zagrobelny等[73]通過Roche公司454的焦磷酸測序法測定了六星燈蛾Zygaena filipendulae的轉錄組，隨后結合各轉錄本序列的長度和拷貝數分析，以及六星燈蛾與黑腹果蠅、家蠶、產氰蝶Heliconius的系統發育關系的分析確定了生物活性物質氰苷的潛在合成基因，該研究表明基于焦磷酸測序技術的轉錄組分析方法在獲取生物體內天然生物活性物質的合成基因等相關信息方面具有非常重要的作用。

4 展望

近些年來代謝工程手段被引入到細胞工廠改良的研究中，并取得不錯的效果，特別是以轉錄組學為代表的組學技術的應用增強了代謝工程的指導性與可預見性，使代謝工程得到重大革新，有力推動了工業生物技術發展[74]。目前，在以轉錄組學為代表的組學技術指導下的代謝工程正日益成為研究的熱點，國內外關于組學研究的研究中心及公司紛紛成立，科學工作者獲得了空前大量的反映生命活動的數據。與此同時，如何更好地理解、運用這些生命信息也成為擺在我們面前的一個重大挑戰，目前組學數據分析主要是通過比較組學數據差異完成的，組學層次模型還不多見。為了更加合理、高效地實現細胞改良，還需要不同專業背景的科學工作者通力合作，特別是在信息學、數學的幫助下模擬和設計合成新的生物系統，建立相應動力學模型和控制模型，從而提高現有生物基產品的產量、合成新的生物基產品。

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Transcriptome platforms and applications to metabolic engineering

Shuobo Shi1,2, Tao Chen1,2, and Xueming Zhao1,2

1Key Laboratory of Systems Bioengineering,Ministry of Education,Tianjin University,Tianjin300072,China
2Edinburg-Tianjin Joint Research Centre for Systems Biology and Synthetic Biology,Tianjin300072,China

Received:April 30, 2010;Accepted:July 22, 2010

Supported by:National Science Foundation of China (Nos. 20806055, 20875068), National Basic Research Program of China (973 Program) (No.2007CB707802).

Corresponding author:Tao Chen. Tel: +86-22-27406770; E-mail: chentao@tju.edu.cn

國家自然科學基金項目 (Nos. 20806055, 20875068)，國家重點基礎研究發展計劃 (973計劃) (No. 2007CB707802) 資助。