一種新型溫控系統在胰島干細胞分離中的應用

胡亮，馮靖祎，呂穎瑩

浙江大學醫學院附屬第一醫院 醫學工程科，浙江 杭州 310003

一種新型溫控系統在胰島干細胞分離中的應用

胡亮，馮靖祎，呂穎瑩

浙江大學醫學院附屬第一醫院 醫學工程科，浙江 杭州 310003

基于半導體變溫的溫度控制系統應用于胰島干細胞分離，探索胰島干細胞分離過程溫度精密控制對胰島干細胞分離效果的影響。溫度控制系統利用熱電冷卻器的快速調溫功能，并利用單片機調節PID參數，從而實現對目標溫度的調控。采用雄性Balb/c小鼠作為供體分離胰島，比較不同的胰島分離過程溫度控制方式得到的胰島的效果差異。本溫度控制系統應用后，每只小鼠胰腺分離純化后收獲量為(109±32) IEQ，胰島純度為96.2%±1.9% 。

胰島干細胞分離；PID控制；熱電冷卻器；溫度控制

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課題/研究背景：受浙江省科技計劃項目(2008F70028)資助。從供體的胰腺中獲得純度高、數量多、活力強的胰島細胞是進行胰島干細胞移植的先決條件。用于胰島干細胞分離的復合膠原酶的活性和溫度是密切相關的，因此胰島及胰腺干細胞分離過程需要精確的溫度控制。本課題主要研制了一種用于胰島干細胞分離過程的溫度控制系統。

應用要點：把胰腺的灌注與消化都集中在不銹鋼消化罐內進行，在供體胰腺灌注階段只要把系統的溫度設定到4℃即可，灌注完畢只要把系統的溫度設定到37℃即可，灌注與消化時間可按照實際需求來控制。

實驗設計/論文構思：首先對系統的溫度控制進行溫度實際測量，測試系統的溫度控制精度。采用不同的溫度控制方法對實驗小鼠的胰腺進行灌注與消化，并對實驗小鼠胰腺分離結果進行對比。實驗結果表明本系統溫度控制精確，可以提高胰島分離效果。

糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是一種嚴重威脅人類健康的多發性代謝疾病，而且發病率逐步上升。胰腺器官移植雖然可以有效地控制血糖代謝，提高生活質量[1]，但胰腺移植因手術創傷大、外科并發癥多，治療風險較大，并非糖尿病治療的最佳方法[2]；細胞替代治療是根治胰島素依賴的糖尿病的最終手段[3]，胰島干細胞移植是實現患者血糖長期穩定的有效方法。目前胰島干細胞移植作為治療糖尿病的一種新方法,已經展現出極其廣闊的臨床應用前景及巨大的社會與經濟效益[4,5]。

從供體的胰腺中獲得純度高、數量多、活力強的胰島細胞是進行胰島細胞移植的先決條件[6]。用于胰島干細胞分離的復合膠原酶的活性和溫度是密切相關的，胰島及胰腺干細胞分離過程需要精確的溫度控制。目前國內外胰島移植細胞分離溫度控制主要采用兩種方法：一種方法是通過冰袋的冷卻，在酶灌注時將溫度維持在4℃，當進行酶消化時再用電熱絲加熱至37℃；另外一種方法是在水浴箱上實現4℃和37℃的控制，水浴溫度控制下的胰島分離示意圖如圖1[7]所示。用這兩種方法來進行胰島分離的溫度控制效果都不很理想。用第一種方法進行溫控時，由于電熱絲的熱慣性很大，經常發生溫度過沖，溫控精度不夠，嚴重影響了胰島細胞的分離數量和存活質量。第二種方法雖然可以比較好地實現溫度控制的要求，但是水浴加熱升溫緩慢，升溫速率不高。酶的消化有時間性，過長的加熱過程會降低酶對胰腺的催化效果，而且水浴方法需要管路連接，在管路上會有熱量散發，不能保證酶進入消化罐時的溫度為37℃。

圖 1 水浴溫度控制下的胰島分離示意圖

1 半導體變溫的基本原理與應用

1834年法國物理學家帕爾貼發現，當有外加的直流電流流過由兩種不同材料組成的封閉回路時，并在串聯的閉合回路中通以直流電流時，在其兩端的結點將產生吸熱或放熱的現象，這一現象為帕爾貼效應[8]。帕爾貼效應示意圖如圖 2 所示。

接通電源后，冷端的熱量被移到熱端，導致冷端溫度下降，熱端溫度上升。由于半導體變溫元件體積小，不需要任何制冷劑，無需壓縮機、蒸發器等龐大的機械裝置。半導體變溫技術在低溫生物學、超導技術、低溫外科學、低溫電子、通訊技術、激光技術、紅外技術，以及空間技術等領域具有廣泛的應用[9,13]。

圖 2 帕爾貼效應示意圖

2 系統的溫度控制電路

本系統的溫度控制對象是胰島及胰腺干細胞分離的消化罐，通過鍵盤輸入消化罐工作溫度設定值，高靈敏度的熱敏電阻溫度傳感器所測量的溫度信號，經CPU(STC12C5A60AD/S2)的A/D口進行A/D轉換，處理器把所測得的溫度值送LCD液晶屏顯示，同時將其與鍵盤設定的溫度值進行比較，將差值進行PID處理后通過PWM脈寬調制控制功率輸出電路，實現對半導體制冷器的精確控制，從而構成了實時閉環溫度控制系統。系統的溫度控制電路結構框圖如圖3所示。

圖 3 溫度控制電路結構框圖

3 系統溫度控制策略

系統溫度控制采用PID控制。PID控制器是一種比例、積分、微分并聯負反饋控制器。本文采用軟件脈寬調制技術，利用PID算法控制單片機輸出占空比可變的PWM信號，實現了對溫度的精確控制。

4 動物實驗

我們通過對實驗小鼠的胰腺灌注與消化過程的溫度控制，對比傳統水浴法溫度控制與本系統溫度控制的優越性。

4.1 材料與方法

雄性Balb/c小鼠(8～12周齡，購至上海實驗動物研究所，中國）；膠原酶Ⅺ（Sigma公司）；Ficoll 400（Sigma-AlDrich公司）；HBSS（invitrogen公司）；電子溫度表（Fluke公司，50Ⅱ）；Legend RT低溫水平離心機（Sorvall LEGEND RT）；手術顯微鏡（江蘇鎮江中天光學儀器公司，LZL-6A）；體式顯微鏡（Leica S60）；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海森信實驗儀器有限公司)；半導體變溫溫度控制系統（自制）。

提取胰島用鼠采用4%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.2mL/20mg體重），常規固定，消毒，小切口心前區開胸，破心放血處死。迅速“十字切口”開腹，暴露第一肝門，緊貼十二指腸乳頭處膽總管下端結扎，膽囊管部位膽總管帶線，同時在該部位30G針頭順行穿刺，針孔處帶線結扎,1～2min內灌注2mL液體。

將兩個分離的胰腺放置在含有6mL HBSS（或含有0.5mg/mL膠原酶Ⅺ）的同一根50mL離心管內，將裝有胰腺和6mL HBSS（或含有0.5mg/mL膠原酶Ⅺ）的50mL離心管放入37℃水浴中靜置消化，消化時間為12min，消化后將離心管迅速取出，用力振蕩10～20s使胰腺呈泥沙狀，加入4℃ 的0.1%BSA-HBSS振蕩10～20s終止消化。動物手術一般控制在30min內完成。

表 1 不同的胰腺分離過程溫度控制方式分離純化后獲得的胰島數量和純度

通過不同的分離過程溫度控制策略分離純化胰島，對分離出的胰島數量和活性進行統計。采用雙硫腙特異染色法（DTZ）染色，顯微鏡下觀察胰島的純度和得率，并通過吖啶橙（AO）/碘化丙啶（PI）染色檢查分離獲得的胰島活性，比較不同的分離過程溫度控制策略分離純化胰島數量和活性。

溫度控制方法A：胰腺的灌注在底部放滿冰的不銹鋼盤子里進行，時間為2 min；胰腺的消化在DK-8D型電熱恒溫水槽內進行，時間為12 min。

溫度控制方法B：胰腺的灌注在我們自制的半導體變溫溫度控制系統的消化罐里進行，時間為2 min；胰腺的消化也在我們自制的半導體變溫溫度控制系統的消化罐里內進行，時間為12 min。

4.2 實驗結果

采用水浴法來控制胰腺的灌注與消化過程的溫度控制，在灌注時實驗小鼠腔內的溫度為(6±3)℃，消化的加溫速率是12 min，恒溫效果為(37±2.5)℃；采用我們自制的半導體變溫溫度控制系統，胰腺的灌注與消化全在系統的消化罐內進行，灌注時溫度為(4±0.3)℃，消化的加溫速率是6 min，恒溫效果為(37±0.5)℃。表1是在其它條件相同的情況下不同的胰腺分離過程溫度控制方式分離純化后獲得的胰島數量和純度。

由表1可以看出在系統投入運行后，胰島干細胞的數量和質量都有明顯的提高。可見對胰島分離過程溫度的精確控制可以提高胰島分離的數量和活性。

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Application of the Temperature Control System to Islet Stem Cell Separation Based on the Varied Temperature of Semiconductor

HU Liang,FENG Jing-yi, LV Ying-ying
Medical Engineering Department,First Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou Zhejiang 310003,China

TP273+.2；R329.2

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2010.11.005

1674-1633(2010)11-014-03

2010-08-13

2010-10-17

本文作者：胡亮，碩士，工程師，浙江省醫學會生物醫學工程分會青年委員。

馮靖祎，碩士，高級工程師，中華醫學會生物醫學工程分會委員、浙江省醫學會生物醫學工程分會候主任委員。

通訊作者郵箱：jingyi@mail.hz.zj.cn

Abstract:Temperature control system,based on the varied temperature of semiconductor and applied to islet stem cell separation, are utilized to explore the effect, which is caused by process of precise temperature control of islet stem cells, on the impact of islet stem cell separation. With the utilization of the fast tempering function of the thermoelectric cooler and the Single-chip Microcomputer adjusting PID parameters, temperature control systems are used to achieve the regulation of the target temperature. Male Balb/c mice were used as the donors to separate islet, and we could compare the different effects of diverse temperature control methods in the procedures of the islet separations. As a result of the application of the temperature control systems, pancreas were purified with a harvest of (109±32) IEQ and the islet purity of 96.2±1.9% of each mouse.

Key words:islet stem cell separation;PID control;thermoelectric cooler; temperature control