雛雞感染柔嫩艾美爾球蟲局部黏膜免疫細胞的動態變化

王芝英，周作勇，聶 奎

(1.西南大學榮昌校區動物醫學系，重慶榮昌402460；2.西南大學動物科技學院，重慶北碚400716)

雞柔嫩艾美爾球蟲為一種單細胞動物，經口感染侵入雞盲腸黏膜上皮細胞進行胞內寄生[1]。在此過程中，動物機體腸道黏膜免疫系統構成了抗球蟲感染的第一道免疫屏障。腸道免疫細胞主要有T、B淋巴細胞和漿細胞[2]。T淋巴細胞亞群，尤其是CD4+T細胞和CD8+T細胞，與機體抗球蟲免疫密切相關[3-4]，而B淋巴細胞和漿細胞大部分為IgA分泌細胞，主要產生分泌型IgA(sIgA)[2]，sIgA能與球蟲子孢子結合并阻斷子孢子的入侵過程和抑制其細胞內發育過程[5-6]。Lillehoj H S等(1992)[7]、Zigterman G J 等(1993)[8]、Cheol H Yun 等(2000)[9]、Beattie S E等(2001)[10]和葉秀華等(2008)[11]只是分別對雛雞感染球蟲腸道IgA+細胞或T細胞亞群的動態變化進行了研究。本試驗旨在于對柔嫩艾美爾球蟲感染雞的盲腸黏膜T細胞亞群與sIgA+細胞數量動態變化同時進行檢測，以較系統地探討腸道黏膜免疫在抗球蟲感染中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗蟲株 柔嫩艾美爾球蟲(榮昌株)，由西南大學榮昌校區寄生蟲病學實驗室提供。試驗前用健康無球蟲感染雞進行擴繁，29℃孢子化，4℃保存備用。

1.2 試驗動物及飼料 1日齡羅曼公雛100只，購自四川省內江種雞場。分籠飼養于經火焰消毒的鐵絲籠中飼喂自配無抗球蟲藥的飼料。

1.3 主要生物制劑 鼠抗雞IgA純化抗體(批號：I138-R376)，鼠抗雞 CD4(批號 ：J056-WK55Z)單克隆抗體、鼠抗雞 CD8α(批號：C687-X208U)單克隆抗體，美國SouthernBiotech公司產品。辣根酶標記羊抗小鼠多聚體二步法檢測試劑盒(非生物素)(批號：105271)，DAB 染色試劑盒(批號：50681680)，北京中杉金橋生物技術有限公司產品。

1.4 試驗分組及處理 100只羅曼公雛飼喂至13日齡，隨機分為球蟲感染組(I組)和未感染球蟲對照組(C組)，每組50只。15日齡時，對I組雛雞經口接種柔嫩艾美爾球蟲孢子化卵囊5.0×104個/只，C組雞接種蒸餾水。

1.5 樣品采取及指標檢測 分別于接種球蟲后第2、4、5、7天和第9天，I組和 C組每組隨機捕殺 4只，采取盲腸中段，作石蠟切片并進行酶免疫組化技術間接法染色，檢測盲腸黏膜中sIgA+細胞、CD4+、CD8+T細胞。

1.6 結果觀察及統計分析 用Olympus生物顯微鏡觀察免疫組化染色切片并照相，用 Image Pro plus 5.0圖象系統測量軟件對每張切片5個視野單位面積內sIgA+細胞、CD4+、CD8+T細胞的數量進行計算，統計單位面積內陽性細胞的數量，結果用SPSS 11.5軟件進行統計學分析。結果以平均值±標準差(±S)表示。

2 試驗結果

2.1 盲腸組織中sIgA+細胞的分布及數量 盲腸組織中sIgA+細胞呈圓形或者橢圓形，有核空位，呈深棕色，主要分布于盲腸組織的固有層中，盲腸絨毛中部及其以下部位和腸腺周圍(圖1)。接種球蟲后第2，4天和第5天，sIgA+細胞數量呈上升趨勢，第5天達到高峰，第7天和第9天逐漸下降，球蟲感染組雞只盲腸組織的sIgA+細胞數量均高于不感染對照組，在接種球蟲后第4天和第5天達到差異極顯著水平(P＜0.01)(見圖2和表1)。

2.2 盲腸組織中T細胞亞群的變化

2.2.1 盲腸組織中CD4+T細胞的變化 CD4+T細胞主要分布于盲腸組織的固有層中，腸腺周圍，細胞呈圓形或橢圓形，呈深棕色(圖3)。接種球蟲后第2～9天，球蟲感染組盲腸組織CD4+T淋巴細胞數量均高于不感染對照組，在接種球蟲后第2天盲腸組織CD4+T細胞數量就顯著升高，第5天達到高峰，隨后第7天逐漸下降，與不感染對照組差異極顯著(P＜0.01)(見圖4和表1)。2.2.2 盲腸組織中 CD8+T細胞亞群的變化CD8+T細胞主要分布于盲腸組織的固有層中，腸腺及黏膜上皮之間。細胞呈圓形或橢圓形，呈深棕色(見圖5)。接種球蟲后，感染球蟲組雞只盲腸中的CD8+T細胞數量均高于不感染球蟲組，第 4，5，7天，感染球蟲組的CD8+T細胞數量增加迅速，第7天達到高峰，與不感染對照組相比，差異顯著(P＜0.05)，第9天略有降低(見圖6和表1)。

表1 雛雞感染柔嫩艾美爾球蟲盲腸絨毛sIgA+細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞動態變化

圖2 盲腸黏膜sIgA+細胞計數結果

圖3 盲腸黏膜CD4+T細胞的免疫組化染色(箭頭所示)(×400)

圖4 盲腸黏膜CD4+T細胞計數結果

圖5 盲腸黏膜CD8+T細胞的免疫組化染色(箭頭所示)(×400)

圖6 盲腸黏膜CD8+T細胞計數結果

3 分析討論

雞球蟲具有寄生部位特異性的特點，柔嫩艾美爾球蟲主要寄生于盲腸，孢子化卵囊被雞吞食后，在肌胃中受機械作用，卵囊壁破壞釋放出孢子囊，在膽汁和胰酶作用下子孢子逸出，后者侵入盲腸上皮細胞到達隱窩上皮細胞，并在其中發育，進入第一代裂體生殖階段。盲腸黏膜在識別球蟲子孢子后，即會分泌IgA抗體，阻斷子孢子的入侵過程和抑制其細胞內發育[5-6]。腸道sIgA滴度的升高是抗原刺激下細胞因子調控免疫球蛋白重鏈轉換表達和sIgA+細胞數量增加的雙重結果[12]。本研究發現，感染球蟲后，雛雞盲腸sIgA+細胞的數量呈上升趨勢，在感染后第2天即開始大量增加，第5天達到高峰期，極顯著高于不感染對照組(P＜0.01)，而在第7天和第9天逐漸下降。說明雛雞盲腸組織受到球蟲的刺激后，腸道組織漿細胞的活化逐漸加強，分泌特異性sIgA來抑制或殺滅球蟲入侵。而對照組隨著日齡增加腸道黏膜sIgA+細胞數量略有增多既是腸道黏膜發育的結果，也可能是由于環境抗原(包括食物抗原成分)不斷刺激的反映[12]。

在柔嫩艾美爾球蟲侵入腸上皮細胞期間，子孢子和第一代裂殖子均可刺激T細胞活化、增殖，并分化為CD4+T細胞和CD8+T細胞。CD4+T細胞是主要誘導群，可通過產生IL-2、IL-4、L-6和INF-γ等重要細胞因子直接參與抗球蟲細胞免疫反應[7，9，13]。CD8+T細胞在感染早期可以阻止子孢子移行，抑制蟲體發育，而在感染后期則主要通過細胞毒效應和殺傷功能直接溶解和破壞靶細胞[8，14]。本研究發現，雛雞感染柔嫩艾美爾球蟲后，盲腸組織中CD4+T細胞和CD8+T細胞均高于不感染球蟲對照組，其中，CD4+T細胞數量在感染后第2天即顯著升高，第5天達到高峰，極顯著高于不感染對照組(P＜0.01)，隨后第7天逐漸下降。CD8+T細胞數量大幅度增加時間略遲于CD4+T細胞，第4、5、7天，感染球蟲組的CD8+T細胞數量增加迅速，感染后第7天達到高峰，與不感染對照組相比，差異顯著(P＜0.05)，第9天略有降低。說明當雞只感染球蟲后，CD4+和CD8+T淋巴細胞都參與細胞免疫過程，CD4+T淋巴細胞作為調節細胞，主要是啟動免疫應答和控制初次感染，而CD8+T淋巴細胞作為一種效應細胞，則是抵抗再感染的主力。因此CD4+T細胞數量顯著增加的時間早于CD8+T細胞，在感染后2 d即可顯著高于不感染對照組[14]。本研究還發現sIgA+細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞的變化趨勢和球蟲內生階段發育有密切的關系，在雛雞感染球蟲后sIgA+細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞就會迅速增加，而隨著球蟲在機體內裂體生殖數量減少，盲腸組織中局部黏膜陽性免疫細胞有所降低，但是這3種免疫細胞的動態變化不近相同，表明雛雞感染球蟲后，機體能迅速啟動黏膜免疫應答，不同的免疫細胞在抵抗柔嫩艾美爾球蟲感染不同階段發揮不同的作用。

[1] Findly R C，Roberts S J，Hayday A C.Dynamic response of murine gut intraepithelial T cells after infection by the coccidian parasite Eimeria[J].Eur J Immunol，1993，23：2557-2564.

[2] Yun C H，Lillehoj H S，Lillehoj E P.Intestinal immune responses to coccidiosis[J].Dev Comp Immunol，2000，24：303-324.

[3] Lillehoj H S.Role of T lymphocytes and cytokines in coccidiosis[J].Int J Parasitol，1998，28：1071-1081.

[4] Hong Y H，Lillehoj H S，Lee S H，et al.Analysis of chicken cytokine and chemokine gene ex pression following Eimeria acervulina and Eimeria tenella infections[J].Vet Immunol Immunopathol，2006，114：209-223.

[5] Davis P J，Porter P.A mechanism for secreto ry IgA mediated inhibition of the cell penetration and intracellular development of Eimeria tenella[J].Immunology ，1979 ，36 ：471-474.

[6] Trees A J，Karum M J，McKellar S B，et al.Eimeriatenella：local antibodies and interactions with the sporozoite surface[J].J Protozool，1989 ，36 ：326-333.

[7] Lillehoj H S，Chung K S.Postnatal development of T-lymphocyte subpopulations in the intestinal intraepithelium and lamina propria in chickens[J].Vet Immunol Immunopathol，1992，31：347-360.

[8] Zigterman G J，van de Ven W ，van Geffen C，et al.Detection of mucosal immune responses in chickens after immunization or infection of Eimeria tenella[J].Vet Immunol Immunopathol，1993 ，36 ：281-291.

[9] Cheol H Yun，Hyun S Lillehoj，Kang D Choi.Eimeria tenella infection induces local gamma interferon production and intestinal lymphocyte subpopulation changes[J].Infect Immun，2000，68：1282-1288.

[10]Beattie S E ，Barta J R，Fernando M A.Involvement of CD8+and CD3+lymphocytes in the transport of Eimeria necatrix spo rozoites within the intestinal mucosa of chickens[J].Parasitol Res，2001，87(5)：405-408.

[11] 葉秀華，蔡建平，吳志光，等.rChIFN-γ對E.tenella卵囊免疫雛雞腸道分泌型IgA+細胞數量的影響[J].中國預防獸醫學報，2008，30(12)：959-963.

[12]Smith A L，Beal R.T he avian enteric immune system in health and disease[M]//Davison F ，Kaspers B，Schat K A.Avian Immunology.London：Academic Press，2008：243-271.

[13]Laurent F，Mancassola R，Lacroix S，et al.Analysis of chicken mucosal immune response to Eimeria tenella and Eimeria maxima infection by quantitative reverse transcription-PCR[J].Infect Immun，2001，69：2527-2534.

[14]劉晶，鄭世民，胡京友.雛雞感染毒害艾美爾球蟲后免疫器官T細胞亞群的動態變化[J].畜牧獸醫學報，2006，37(2)：168-172.