黑龍江漢族人群肌型肌酸激酶基因CKMM- NcoⅠ多態研究

周文婷，李麗文，劉向宇

（1.哈爾濱體育學院 運動人體科學系，黑龍江 哈爾濱 150008；2.東北農業大學，黑龍江 哈爾濱 150030）

黑龍江漢族人群肌型肌酸激酶基因CKMM- NcoⅠ多態研究

周文婷1，李麗文2，劉向宇2

（1.哈爾濱體育學院 運動人體科學系，黑龍江 哈爾濱 150008；2.東北農業大學，黑龍江 哈爾濱 150030）

目的：研究黑龍江漢族群體CKMM基因NcoⅠ位點的遺傳多態性分布。方法：應用PCRRFLP法測定120名黑龍江籍漢族健康大學生CKMM基因NcoⅠ位點的基因型和等位基因的頻率分布。結果：等位基因頻率是A=87%, G=13%，基因型頻率為A/A=76% , A/G=22% , G/G=2%，經卡方檢驗符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，其基因型頻率和等位基因頻率在男女間無顯著性差異，與歐美人群相比有非常顯著性差異，而與我國北方漢族人及韓國人相比沒有差異不顯著性。

肌型肌酸激酶基因；聚合酶鏈式反應；限制性片段長度多態

Abstract: Objectives: To study the distribution of genotype and allele frequencies of CKMM gene at NcoⅠloci in Han origin population in Heilongjiang province. Methods: PCR-RFLP was used to determine the genotypes and alleles frequencies of CKMM gene at NcoⅠloci in 120 unrelated healthy university students. Results: The allele frequencies were: A = 87%, G = 13%. The genotype frequencies were A /A = 76%, A /G = 22%, G/G = 2% and they were in Hardy-Weinberg equilibrium. No significant difference was detected in genotype and allele frequencies between men and women. There were significant differences between Han origin population in Heilongjiang province and those in Europe and America, but no significant difference was found between Heilongjiang population and Chinese population, as well as Korean population.

Key words: CKMM gene; PCR; RFLP

CLC number: G804.2 Document code: A Article ID: 1008-2808(2010)06-0001-04

肌酸激酶（CK）通常存在于動物的心臟、肌肉以及腦等組織的細胞漿和線粒體中，是一個與細胞內能量運轉、肌肉收縮和ATP再生有直接關系的重要激酶［1,2］，它可逆地催化肌酸（Cr）與ATP之間的轉磷酰基反應，是該反應的關鍵酶。CK與磷酸肌酸（PCr）組成肌酸-磷酸肌酸穿梭系統，可作為細胞內“暫時的能量緩沖系統”，用以在高能量需求時維持細胞內的ATP/ADP比率［3］；同時作為能量轉運單位, 該系統也作用于將能量從產生部位轉運至利用部位。CK有四種同工酶形式，分別為肌肉型(MM)、腦型(BB)、雜化型(MB)和線粒體型(MiMi)，其中CKMM主要表達于骨骼肌中，在心肌中也有少量表達。研究證實，肌肉中的CKMM主要集中在M線附近［4］，主要功能是在肌球蛋白頭部生成高濃度的ATP，為肌肉收縮及運動供能。此外，CKMM在肌質網(SR)Ca2+ ATP酶的附近也有表達［5］，作用可能涉及Ca2+的再聚集［6］，進而影響肌肉的工作能力。

人的CKMM基因位于染色體的19q13.2～q13.3區域，長度約有17.5 kb，包含8個外顯子和7個內含子。研究表明，在CKMM基因3′端非編碼區存在可能與耐力有關的CKMM-NcoⅠ多態位點，且該位點在我國北方漢族人群中的分布與歐美人群相比具有非常顯著性差異［7］，提示該位點可能與我國北方漢族人和歐美人體質及耐力素質間的顯著差異有關，對于我們認識不同地區、不同種族間人群的體質和運動能力差異具有重要意義。然而，CKMM基因NcoⅠ位點多態性的關聯研究后繼乏力，對其適用性迄今尚無更多佐證，故本研究在已有研究的基礎上對黑龍江籍漢族人的CKMM-NcoⅠ位點多態分布進行探索，旨在為進一步開展群體遺傳學和體育科學研究提供有益的資料。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

健康大學生120例，其中男性82人，女性38人，所有研究對象均為黑龍江籍漢族，彼此無血緣關系受試者基本情況見表1。

表1 受試者基本情況

1.2 實驗方法

取靜脈血2mL, 2%EDTA抗凝，分離白細胞，-20℃保存。采用Promega公司試劑盒提取基因組DNA。PCR-RFLP法解析NcoⅠ位點基因型，PCR擴增引物序列如下：

F: GGGATGCTCAGACTCACAGA；R: AACTTGAATTTAGCCCAACG

PCR反 應 體 系 為：PCR反 應buffer 2μL，1.5 mmol/L MgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μmol/L，上、下引物各0.5μmol/L，Taq酶1U，模板100 ng，無菌水補足至20μL。

PCR反應參數為：94 ℃預變性7 min，94 ℃變性40 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，30個循環，最后72 ℃延伸10 min。取5μL擴增產物在2%瓊脂糖中進行電泳，90 V 40 min檢驗擴增效果。

取PCR擴增產物7 μL、限制性內切酶N coⅠ1μL ( 8 U)、10×緩沖液2 μL和0.1% BSA 2 μL于37 ℃酶切8 h。酶切產物以3%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統紫外光成像。

1.3 統計分析

采用SPSS 16.0統計軟件進行統計學分析。以χ2檢驗計算基因型頻率是否符合Hardy- Weinberg遺傳平衡定律。采用r ×c列聯表卡方檢驗計算與其他人群的基因型分布差異。檢驗顯著性水平定為P＜0. 05，非常顯著性差異定為P＜0. 01。

2 結果與分析

CKMM基因經PCR及N coⅠ內切酶消化以后得到3種條帶：有酶切位點的純合型有153 bp /206 bp 兩條帶，沒有酶切位點的純合型只有359 bp 1條帶，而雜合型有153 bp /206 bp + 359 bp 3條帶，其中153 bp + 206 bp /153 bp + 206 bp 是A/A純合型，359 bp /359 bp是G/G純合型，153 bp + 206 bp/359 bp是A/ G雜合型。

3種基因型分布經卡方檢驗符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P＜0. 05)，具有群體代表性。不同性別受試者在NcoⅠ位點的基因型和等位基因分布頻率均無顯著性差異，與周多奇等［7］研究結果相似，表明黑龍江籍漢族人在該位點與所涉地域更廣的我國北方漢族人多態分布相近，具有典型的北方漢族群體遺傳特征，具體分布見表2。

表2 黑龍江地區漢族人群CKMM 基因N coⅠ位點多態性分布

與加拿大、西班牙和意大利人群相比，黑龍江及我國北方漢族人在該位點的等位基因頻率和基因型頻率與他們均有非常顯著性差異( P＜0. 01)，而與韓國人相比，基因型頻率和等位基因頻率差異均不顯著。在對其他種族間數據進行比較后發現，韓國人與各歐美人群在等位基因頻率和基因型頻率上均呈顯著性差異( P＜0.05)，而歐美各國人群組間則均無顯著性差異（表3）。

表3 不同種族人群CKMM 基因N coⅠ位點多態性分布

個體間體質和運動能力的差異受多種因素影響，其中環境（運動訓練、營養與技術方法）和遺傳因素在很大程度上起決定作用，而在相同的環境下，不同的遺傳背景可能是影響個體間不同體質、不同運動能力的主要原因。受制于倫理學，體質與運動能力的遺傳學研究較長時期內未能廣泛開展。隨著生物技術與分子遺傳學的發展，迄今已有包括214個常染色體基因位點、7個X染色體位點和18個mtDNA序列多態性位點在內的，與人類體質和優秀運動能力有關的基因位點被發現和定位［14］，其中有關耐力素質的研究較多，極大豐富了人們對不同種族、不同地域人群體質和運動能力差異性原因和機制的認識，也更好地促進了群體遺傳學的發展。作為運動能力的重要組成部分，耐力素質是多基因控制的復雜表型。有人研究了多個代謝基因對耐力運動員體型、慢肌纖維比例及最大氧消耗量的綜合作用，發現了10個與耐力相關的基因多態型，而這些基因多態型在運動員中表達的數量越多，運動員的慢肌纖維比例越高，氧消耗量越大，耐力素質也越好［15］。隨著高通量SNP分析技術的應用，更快更方便的全基因組測序技術的發展，基因間的微小、多重、積累的相互作用將被檢測，“運動基因”的探尋進程有望加快，通過分子技術進行優秀運動員選材的愿望將更快實現［16］。CKMM基因N coⅠ多態性是已報道的可能與耐力運動能力和耐力訓練敏感性相關的多態位點，其中雜合型A/G攜帶者被認為可能具有更高的耐力水平和更高的訓練敏感性［7-11］，周多奇等［7］對我國北方漢族人耐力訓練敏感性的研究也對此也予以了證實。本研究發現，黑龍江籍漢族人中A/G基因型的頻率為22%，與我國北方漢族人（24%）中該基因型頻率相似，與韓國人（31%）相比差異也不顯著（P＞0.05），但與歐美各國人相比，其分布頻率非常顯著低于各國（35%～54%）（P＜0.01）；而在韓國人中，其分布頻率也顯著低于歐美各國（P＜0.05），而歐美各國人間其分布頻率無顯著性差異（P＞0.05），表明CKMM基因N coⅠ多態性可能存在種族及地域上的顯著差異，而這或許正是亞洲地區與歐美地區人群間存在較大體質和耐力水平差異的原因之一。當然，由于實驗設計及研究樣本量所限，很多研究都可能出現結論的相悖，然而隨著后基因組計劃及群體遺傳學的的深入開展，相信大量的遺傳學信息將會逐漸彌補這些缺憾，而本研究也將在未來進一步加大樣本含量，以期更準確地描述該基因多態位點的分布特征。

3 結 論

研究首次對黑龍江籍漢族人在CKMM基因NcoⅠ位點的多態分布進行了檢測，結果發現，等位基因頻率分別為A=87%和G=13%，基因型頻率分別為A/A=76%、A/G=22%和G/G=2%，基因型和等位基因頻率在男性和女性間無顯著性差異（P＞0.05），與歐美人群相比頻率差異具有非常顯著性（P＜0.01），而與我國北方漢族人及韓國人相比差異無顯著性（P＜0.05），不僅對我國北方漢族人在CKMM基因N coⅠ位點的多態分布信息進一步予以補充，也為后續更佳深入的群體遺傳學研究和運動能力的分子生物學研究提供了有用的資料。

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Research on Polymorphism in Muscle-speci fi c Creatine Kinase Gene at Nco?loci in Han Origin Population in Heilongjiang Province

ZHOU Wen-ting1, LI Li-wen2, LIU Xiang-yu2
(1. Sports Science of Human Body Dept. in Harbin Institute of P.E., Harbin 150008, Heilongjiang China; 2. Northeast Agriculture University, Harbin 150030, Heilongjiang China)

G804.2

A

1008-2808(2010)06-0001-04

2010-09-10；

2010-12-09

黑龍江省教育廳科學技術研究項目（項目編號：11531253）。

周文婷（1979－），女，講師，博士后，研究方向為運動分子生物學及低氧訓練。