黃瓜抗病基因同源序列的表達分析

許春梅，秦智偉，丁國華，周秀艷

（1.東北農業大學園藝學院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱師范大學生命科學與技術學院，哈爾濱 150025）

霜霉病（Downy Mildew）是一種危害黃瓜生產的世界范圍內的葉部病害，如果防治不力則會造成嚴重損失[1-2]。該病害在黃瓜整個生育期都能發生，主要危害黃瓜葉片，幼苗子葉期即可染病，子葉上出現褪綠色的不規則形小斑點，漸漸變成黃褐色。發病初期時，葉背或者葉緣出現水浸狀淡黃色的不規則小斑點，隨著病情發展，病斑會逐漸擴大，沿著葉脈形成多角型黃色病斑。發病嚴重時小病斑匯集成大病斑，潮濕條件下病斑背面會長出灰黑色的霉層。發病葉由下向上發展，嚴重時導致全株葉片枯萎。1～2周內就能使瓜田全部枯黃，黃瓜產量下降，甚至造成絕產。

抗病基因類似序列（Resistance Gene Analog，RGA）是存在于植物基因組中與已分離出來的30多個抗病基因某些保守序列存在較高同源性的DNA片段[3]。RGA在植物基因組中大量存在，與抗病基因相關的RGA只是其中一部分[4]。不過就現有的RGA的研究來看，NBS類保守域基本只出現在抗病基因當中，而STK（PK）類和LRR類的出現比較復雜。

RGA1、RGA2、RGA4、RGA5、RGA8和RGA10是己克隆的黃瓜抗病基因同源序列片段[3]，其中部分片段具有NBS類型抗病基因的磷酸結合環（p-Loop）和保守結構域（Kinase2）結構。與己克隆的甜瓜RGA基因存在較高的同源性。蛋白同源性分析顯示RGA的推測產物與幾百種蛋白質存在很高的同源性，這些蛋白質基本上都是假定的抗病蛋白[5]。

本研究基于RGA基因在黃瓜中的多態性特征及其產物的抗病蛋白同源性特征，采用半定量方法分析其在黃瓜植株各部位和霜霉菌誘導后各時期的表達情況。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為黃瓜抗霜霉病品種東農129，將種子播種于營養缽中，在人工氣候箱中按光照12 h、黑暗12 h的光周期，18～25℃下培養。在幼苗長至三葉一心時，接種霜霉菌，采樣時間為誘導后0、6、12、18、24、48、72 和 96 h，另對未做任何人工誘導的東農129黃瓜植株材料的子葉、根、果實等采樣保存。

1.2 總RNA、DNA提取與完整性檢測

用上海生工的Trizol RNA提取試劑盒分別提取黃瓜真葉、子葉、莖、果實、根及接種霜霉菌不同時間段的真葉的RNA；用常規方法提取未經人工接種霜霉菌的真葉總DNA；用瓊脂糖電泳和紫外分光光度計檢測RNA和DNA的純度和濃度。

1.3 cDNA的合成

用試劑盒TaKaRaDRRT1900A合成cDNA。

1.4 定量

擴增18S內參基因，通過調整反應體系中cDNA模板量和各種反應底物的濃度，使瓊脂糖電泳上各誘導時間點的PCR產物亮度一致。

1.5 黃瓜抗病基因同源序列RGA的擴增

1.5.1 引物設計

根據己獲得的黃瓜同源序列RGA基因的編碼區序列設計了一對特異性引物（見表1），由上海生工合成，PAGE純化。

表1 用于連鎖和資源分析的RGA特異引物Table1 Special primers of CsRGA for analysis of linkage and germplasm in cucumber

1.5.2 PCR擴增

PCR反應采用25 μL反應體系，分別加入等量不同器官及誘導后不同時間點的cDNA（1 μL）及未做任何誘導的DNA模板（100 ng），10×PCR Buffer（Mg2+）2.5 μL，rTaqDNA 聚合酶（購自 TaKaRa 公司）0.2 μL（5 U·μL-1），dNTPs（購自TaKaRa公司）1.0μL（2.0mmol·L-1），上游引物1.0 μL（20 μmol·L-1），下游引物1.0 μL（20 μmol·L-1），ddH2O 17.8 μL。PCR反應程序為：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸90 s，35個循環，72℃延伸10 min。反應在Eppendorf梯度PCR儀上進行。取5 μL PCR產物加上樣緩沖液經1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈觀察照相。

2 結果與分析

2.1 定量

用半定量RT-PCR方法對黃瓜RGA基因進行分析，18S基因在霜霉病誘導后不同時間的葉片中擴增條帶亮度基本相同（見圖1），以此為對照分析了黃瓜抗病植株東農129中RGA基因的表達情況。

2.2 霜霉菌誘導后RGA基因表達情況

RGA1基因在未誘導的黃瓜抗霜霉病品種東農129葉片中有一定量表達，但表達相對含量較低，在其他組織中無表達，當黃瓜植株受霜霉菌誘導后，誘導18 h后表達水平明顯提高，誘導24 h相對表達量達最高水平，48 h表達量下降（見圖2）。

圖1 接種霜霉病菌后的黃瓜18S基因的PCR產物的電泳Fig.1 Electrophoresis of PCR product of 18S gene in cucumber inoculated with P.cubensis

圖2 接種霜霉病菌后的黃瓜RGA1基因PCR產物的電泳Fig.2 Electrophoresis of PCR product of RGA1 in cucumber inoculated with P.cubensis

RGA4基因在未誘導的黃瓜抗霜霉病品種東農129植株子葉中無表達，在其他器官中均有表達，在霜霉菌誘導植株中也有表達，且表達量明顯增強（見圖 3）。

RGA5在未誘導霜霉病植株中均無表達，但誘導后12 h開始表達，24 h表達相對含量達最高水平，誘導后72 h表達量達誘導前水平（見圖4）。

圖3 接種霜霉病菌后的黃瓜RGA4基因PCR產物的電泳Fig.3 Electrophoresis of PCR product of RGA4 in cucumber inoculated with P.cubensis

圖4 接種霜霉病菌后的黃瓜RGA5基因PCR產物的電泳Fig.4 Electrophoresis of PCR product of RGA5 in cucumber inoculated with P.cubensis

由圖5可知，RGA8在抗霜霉病品種東農129黃瓜植株經霜霉菌誘導后各時間點均有表達，誘導后24 h表達達到高峰，然后慢慢減弱。在葉片以外部位仍表達，但表達量較弱。在霜霉菌誘導后總cDNA中仍有大量表達。

RGA10基因在抗霜霉病品種東農129黃瓜植株經霜霉菌誘導后各時間點均有表達，且誘導前后相對表達量無明顯差異（見圖6）。

圖5 接種霜霉病菌后的黃瓜RGA8基因PCR產物的電泳Fig.5 Electrophoresis of PCR product of RGA8 in cucumber inoculated with P.cubensis

圖6 接種霜霉病菌后的黃瓜RGA10基因PCR產物的電泳Fig.6 Electrophoresis of PCR product of RGA10 in cucumber inoculated with P.cubensis

RGA2基因在抗病品種東農129中經霜霉菌誘導前后均有表達，在誘導后表達量有所增強。由以上表達情況可以看出，霜霉菌可以影響多數RGA基因的表達，經霜霉菌誘導后表達相對含量增強的基因有 RGA1、RGA2、RGA4、RGA5、RGA8；而RGA10的相對表達量在霜霉菌誘導前后都比較高，初步認為RGA10的表達不受霜霉菌的影響。

3 討 論

a.由以上表達情況可初步證明RGA是與黃瓜抗霜霉病有關的調控基因，RGA的表達情況和霜霉菌有密切的關系，這為以后進行RGA基因全長克隆以及黃瓜抗病性的研究奠定了基礎。

b.以穩定表達的18S RNA基因作為對照[6]，用半定量的RT-PCR方法來檢測基因表達情況，并進行定量分析。與傳統的檢驗基因表達的Northern雜交相比較，具有特異性高，操作簡單，可靠性強的優點，在植物基因的表達分析方面應用廣泛。Wan等以微管蛋白基因作為對照，用半定量RTPCR方法研究小麥的鋅蛋白基因屬組成型表達基因[7]。王維平等則以水稻的肌動蛋白基因為對照，用半定量RT-PCR方法，研究發現水稻COI1基因表達受茉莉酸甲酯誘導[8]。

c.運用半定量RT-PCR方法研究黃瓜RGA基因在轉錄水平的表達需要注意以下幾點：① 總RNA和cDNA的質量。只有在總RNA未被降解的情況下才能保證其中mRNA的完整性和隨后反轉錄的cDNA質量，從而真實反映基因的表達。②總RNA的定量。在反轉錄之前，作為起始模板各個樣品中的總RNA質量要一樣，cDNA量和電泳PCR產物量也要一樣，才能保證PCR擴增產物能真實反映基因表達的實際情況。③PCR循環數的確定。PCR擴增產物的量與循環數之間有一定線性關系。前期的擴增產物的量隨循環數的遞增而成比例增加，隨著DNA聚合酶活性的下降和溶液中反應底物的消耗，擴增產物將達到一個平臺。半定量分析的循環數確定在成比例的線性關系范圍內，表達豐度不同的基因半定量分析的PCR循環數不同。

[1]Lebeda A.Screening of wild cucumis species against downy mildew(Pseudoperonospora cubensis)isolates from cucumbers[J].Phytoparasitica,1992,20(3):203-210.

[2]Thomas CE.Downy and powdery mildew-resistant muskmelon breeding line MR-1[J].Hort Science,1986,21:329.

[3]易圖永,謝丙炎,張寶璽,等.植物抗病基因同源序列及其在抗病基因克隆與定位中的應用[J].生物技術通報,2002(2):16-20.

[4]秦跟基,李萬隆,陳佩度.植物抗病基因結構特征及其類似序列的研究進展[J].南京農業大學學報,1999,22(3):102-107.

[5]丁國華,秦智偉,劉宏宇,等.黃瓜NBS類型抗病基因同源序列的克隆與分析[J].園藝學報,2005,32(4):638-642.

[6]Halterman D A,Wei F,Wise R P.Powdery midew-induced Mla mRNAs are alternatively spliced and contain multiple upstream open reading frames[J].Plant Physiology,2003,131(2):558-567.

[7]Wan P,Ling L J,Zhou W J,et al.Cloning,sequence and expression analysis of a zine finger protein gene in wheat[J].Acta Genetion Sinica,2004,31(9):895-900.

[8]王維平,曹凱鳴,王喜萍.水稻中一個與COI1同源的基因克隆及其表達分析[J].復旦學報:自然科學版,2004,43(2):206-209.