新疆大葉紫花苜蓿兩種再生體系的比較

施莉娟，許 雷，溫 洋，蒲小鵬*

（1.甘肅農業大學草業學院，蘭州 730070；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081）

豆科牧草是最具有經濟價值和營養價值牧草之一，紫花苜蓿由于具有營養豐富、適應性強、改土固氮等多個優點被人們冠以“牧草之王”的美稱[1]。近年來隨著DNA重組技術和轉基因技術的廣泛利用，有關抗性紫花苜蓿新品種的研究也越來越多。國外已有將外源基因導入紫花苜蓿獲得再生植株的報道[2-4]。異源目的基因的高效遺傳轉化有賴于植物高頻再生體系的建立[5]，目前雖然已經有許多學者對紫花苜蓿的組織培養進行了大量的研究工作[6-7]，許多實驗室也已經成功建立了自己的紫花苜蓿再生體系，但大多數都是通過先誘導愈傷組織，然后誘導再生芽和根的途徑獲得再生植株[8]，普遍存在再生周期長、再生頻率低等不足[9]。作為基因轉化的受體系統，必須克服這些缺點才能使通過基因轉化途徑改良性狀取得實質性進展[10]。本研究通過對兩種再生途徑各個指標的比較，選擇出一種相對快速并且高效的再生方式，為今后通過基因轉化改良紫花苜蓿性狀建立穩定高效的再生體系作準備。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗研究材料為新疆大葉紫花苜蓿（Medicago sativa L.cv.Xinjiang Daye）品種，種子由甘肅農業大學曹致中教授提供。

1.2 培養基組成

試驗中所用培養基成分如下：①基本培養基為MS培養基，蔗糖3%，pH 5.8，附加不同激素，高溫滅菌；②愈傷誘導培養基：MS+2，4-D 2.0 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1+瓊脂 9 g·L-1；③ 分化培養基 1： MS+6-BA 0.5 mg·L-1L+NAA 0.05 mg·L-1+瓊脂 9 g·L-1；④ 分化培養基 2：MS+5 μmol·L-1TDZ+0.5 mg·L-1NAA+瓊脂0.8%；⑤生根誘導培養基：1/2MS+IBA 1 mg·L-1+蔗糖 1.5%+瓊脂 0.8%。

1.3 培養方法

1.3.1 胚胎發生途徑

1.3.1.1 外植體的獲得

選擇籽粒飽滿、有光澤的種子在流水下沖洗1 h，在超凈工作臺用70%的酒精浸泡50 s，無菌水沖洗3～5次，再用10%的次氯酸鈉震蕩處理30 min，無菌水沖洗6～8次，無菌濾紙吸干。將消過毒的苜蓿種子接種至不含激素的MS培養基上，培養室培養（光照培養，強度為1 000～2 000 lx，晝夜溫度為25℃左右）。20 d后取無菌幼苗的葉片作為試驗用外植體。

1.3.1.2 愈傷組織的誘導

參照梁慧敏等[11]、王瑞云等[12]方法，將20日齡的無菌苗葉片切成0.5 cm2左右的小塊接入愈傷誘導培養基[13]，每20 d繼代一次，培養條件為黑暗培養20 d后光照培養10 d；光周期16 h，光照強度1 000～2 000 lx，晝夜溫度為25℃左右。記錄外植體愈傷產生時間，30 d后統計出愈率、正常的愈傷組織率。

1.3.1.3 叢生芽的分化

愈傷組織經過30 d的誘導，淘汰褐色的愈傷，篩選出呈黃白色、漿糊狀、水分含量高、表面有突起的組織（見圖版Ⅰ-A）接入分化培養基，一段時間之后，漿糊狀的胚狀體上出現許多綠色小顆粒（見圖版Ⅰ-B），當成團狀的胚狀體長得較大時，可將其分割培養，有利于體胚分化。每20 d繼代一次。培養條件為光周期16 h，光照強度1 000～2 000 lx，晝夜溫度為25℃左右。記錄出芽時間，統計芽分化率和單個組織生芽數（見圖版Ⅰ-C）。

1.3.1.4 根的誘導

待分化苗（見圖版Ⅰ-D）長至1 cm高時，在節間下部處將幼芽切下，移入生根培養基，每20 d繼代一次，記錄生根時間，統計生根率及單個幼苗生根數（見圖版Ⅰ-E）。

1.3.2 器官發生途徑

1.3.2.1 外植體的獲得

在滅過菌（方法同上）的種子中加入約50 mL的無菌水，置于黑暗中溫育過夜。第2天，在超凈臺上用解剖針將萌動的種子撥去種皮（見圖版Ⅰ-F），切去一部分胚根（見圖版Ⅰ-G），再將子葉從中間沿胚軸均勻平滑的分開（見圖版Ⅰ-H），作為本試驗的兩個外植體。將帶胚軸的子葉置于無激素的MS培養基中，暗培養3 d。

1.3.2.2 叢生芽的分化

參照許仕珍[14]的方法，將暗培養3 d后出芽的外植體（見圖版Ⅰ-I）轉入分化培養基2，送入培養室，培養條件為光周期16 h，光照強度1 000～2 000 lx，晝夜溫度為25℃左右。20 d繼代一次。記錄出芽時間，25 d以后，統計出芽率及單個外植體產生再生芽的數量。

1.3.2.3 根的誘導

參照馬暉玲等方法[15]，將生長了一個月的叢生芽（見圖版Ⅰ-J）切開，把單個的再生芽轉入生根誘導培養基，記錄生根時間，20 d以后，統計生根率、單個幼苗（見圖版Ⅰ-K）生根數。

1.4 再生頻率的統計

紫花苜蓿從接種外植體到再生植株需要一段不短的時間，同時涉及好幾個關鍵階段，因而，評價苜蓿的再生頻率必須從這幾個階段綜合考慮。在理想狀態下（不考慮在試驗中因人為操作引起的污染等其他影響試驗結果統計的因素），用如下公式計算再生頻率[14]：

器官形成途徑：再生頻率（%）=外植體萌發率（%）×芽的分化率率（%）×平均單個外植體生芽數（個）×生根率（%）×平均單個幼苗生根數（個）；

胚胎發生途徑：再生頻率（%）=出愈率（%）×芽的分化率率（%）×平均單個外植體生芽數（個）×生根率（%）×平均單個幼苗生根數（個）；

其中：外植體出芽率（%）=萌發的材料數/接種的外植體數×100%；

出愈率（%）=誘導出愈傷組織的外植體數/接種的外植體數×100%；

芽的分化率（%）=分化出芽的材料數/接種的材料總數×100%；

平均單個外植體生芽數（個）=分化的叢生小芽總數/從生芽總數；

生根率（%）=生根的幼苗數/接種的幼苗總數×100%；

平均單個幼苗生根數（個）=誘導生出的根總數/生根幼苗數。

2 結果與分析

2.1 再生時間的比較

本試驗中新疆大葉紫花苜蓿再生幼苗的生成，兩種途徑所用時間相差明顯，器官形成途徑中從種子消毒到再生幼苗的生成所需的時間為69 d左右（種子處理1 d+外植體預培養3 d+芽分化培養約25 d+生根約20 d+再生幼苗培養約20 d≈69 d），而胚胎發生途徑中從接種到再生幼苗的生成大約需要125 d（外植體的獲得20 d+愈傷誘導約30 d+芽分化約45 d+生根約30 d≈125 d）。利用成熟種子胚的再生方式最大特點就是不通過愈傷組織，直接誘導苜蓿叢生芽，其最大的優點就是能快速地產生叢生芽，外植體接入芽分化培養基25 d后就可以用來生根。而傳統的胚胎發生途徑，外植體經過脫分化形成愈傷組織后經過再分化階段，然后才是根的誘導形成植株，本試驗中，兩種再生方式在生根時間上差異不是很大，最顯著的差異就是外植體的準備和芽分化上，本文中胚胎發生途徑選擇生長15～20 d時間的無菌苗葉片作為試驗外植體，即使外植體選擇準備時間較少的下胚軸也需要5～6 d，在這之后需要一個月左右的時間進行愈傷組織的誘導，從愈傷到分化出叢生芽又是一個很長的過程。而器官發生途徑中外植體的獲得僅需要1 d的種子預處理，接下來的過程又避開了愈傷組織誘導，25 d后就有叢生芽生出，并且每個芽又分離出好幾個小芽，直接進入生根階段，大大縮短了再生時間。顯然，器官形成途徑再生所需時間遠遠少于胚胎發生途徑，使再生幼苗的完成節約了55 d左右。

2.2 再生頻率的比較

從表1看出，新疆大葉紫花苜蓿器官發生途徑中子葉外植體的再生頻率（396.57%）是胚胎發生途徑中葉片外植體再生頻率（121.52%）的三倍多，最主要的差距還是在芽分化率上，器官發生途徑可以在較短的時間（約69 d）內達到較高的分化率，而傳統的胚胎發生途徑經過脫分化形成愈傷、再分化形成植株這樣一個漫長的過程后（約125 d），得到的再生頻率反而不是很理想，這也再次體現了紫花苜蓿再生體系的建立周期長、頻率低的特點。

表1 兩種再生途徑各項再生指標及再生頻率的比較Table1 Comparison of regeneration index and regeneration rate of two difference regeneration ways

3 討論與結論

直接誘導叢生芽的再生途徑具有再生周期短（69 d左右）、再生頻率高（396.57%）的特點，而傳統的再生方式大多數都是通過先誘導愈傷組織，然后誘導再生芽和根的途徑獲得再生植株，苜蓿愈傷再生成苗的主要問題是愈傷分化率偏低，不能滿足進行高效遺傳轉化研究的需要[16]。相比之下，器官發生途徑利用成熟種子的胚直接誘導叢生芽分化成苗，此過程不需要誘導愈傷，無論是再生周期還是再生頻率都具有明顯優勢。用此種方式再生紫花苜蓿的報道國內較少，研究不是很成熟，但是鑒于此方法的諸多優點，有必要更進一步完善這一體系，以建立一套普遍適用的快速高效的紫花苜蓿再生體系，并推廣應用到其他植物中去[14]，這對將來的分子生物學研究具有重大的現實意義。

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