HPLC法檢測(cè)耳聾左慈丸中馬錢苷方法研究

陸旋 張星海 黃雪梅

(浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用工程系 浙江 杭州310018)

分析測(cè)試

HPLC法檢測(cè)耳聾左慈丸中馬錢苷方法研究

陸旋 張星海 黃雪梅

(浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用工程系 浙江 杭州310018)

目的：建立以HPLC法測(cè)定耳聾左慈丸中馬錢苷的含量方法。方法：采用Agilent 1100高效液相，以波長(zhǎng)240 nm，柱溫20℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 uL；從色譜柱種類、流動(dòng)相種類等方面來篩選馬錢苷檢測(cè)條件；從線性范圍、回收率、精密度、重現(xiàn)性及穩(wěn)定性等方面進(jìn)行考察。結(jié)果：以Hypersil ODS C18柱(5 um,250 mm×4.60 mm)色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液（12:88）為流動(dòng)相檢測(cè)效果良好。該方法在0.1272～3.18 μg內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.9994），進(jìn)樣精密度良好（RSD=0.4%，n=6），進(jìn)樣重現(xiàn)性良好（RSD=0.5%，n=6），準(zhǔn)確度良好（平均回收率為99.6%，RSD=0.5%，n=6），穩(wěn)定良好（在27 h內(nèi)檢測(cè)7次，RSD為0.7%，n=7)。結(jié)論：本法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠、專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好。

馬錢苷；耳聾左慈丸；HPLC；質(zhì)量分析

耳聾左慈丸為藥典品種，是根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，由山磁石、熟地黃、山茱萸、澤瀉、茯苓、牡丹皮、山藥等中藥加工成的純中藥制劑，具有滋腎平肝的功效，用于肝腎陰虛耳鳴耳聾，效果顯著[1-4]。耳聾左慈丸是目前廣泛使用的一個(gè)制劑，處方中山茱萸藥材主要含有馬錢苷、熊果酸、齊墩果酸等有效成分，馬錢苷是山茱萸的活性成分有效成分。山茱萸中的熊果酸和齊墩果酸是用用薄層色譜來檢測(cè)的，馬錢苷本實(shí)驗(yàn)是用液相來檢測(cè)。本研究以馬錢苷為主要研究指標(biāo)，內(nèi)容包括線性范圍，精密度，重復(fù)性，穩(wěn)定性，回收率，樣品含量測(cè)定等方面，建立了HPLC法測(cè)定耳聾左慈丸中馬錢苷含量方法。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

耳聾左慈丸（杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司提供，生產(chǎn)批號(hào)分別是：060401、071211、071212、080201；三九黃石制藥廠提供，生產(chǎn)批號(hào)分別是：080301、 080505、080603；北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠提供，生產(chǎn)批號(hào)分別是：4030020、4030306、4030307、5013094、5013066、5013013）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

乙腈、甲醇為色譜純；磷酸、醋酸均為分析純。馬錢苷對(duì)照品 （中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111640-200502，供含量測(cè)定用）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀(Agilent 1100)；紫外可見分光光度計(jì)(TU-1901)；電子天平(METTLER AG-285)。

2 方法

2.1 檢測(cè)準(zhǔn)備

2.1.1供試品溶液制備

取本品，研細(xì)，精密稱取1 g，精密加入80%甲醇25 mL，稱重，水浴回流60 min，放冷，稱重，加入80%甲醇補(bǔ)足重量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2陰性樣品溶液制備[5]

取缺山茱萸的耳聾左慈丸樣品1 g,同法制成陰性對(duì)照溶液。

2.1.3 對(duì)照品溶液制備[6]

取經(jīng)五氧化二磷為干燥劑減壓干燥24 h馬錢苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含30 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.4色譜條件

色譜柱：依利特 Hypersil ODS-C18(5 μm,250 mm×4.60 mm)柱號(hào)：E1523089；Kromasil 100-5 C18(5 μm,250 mm×4.60 mm)E 34067；SHIMADZU VPODS C18 (5 μm,250 mm×4.60 mm)serial No. 6122225；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（12:88）；檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm；柱溫為25℃；流速1.0 mL/min。

2.2 色譜條件優(yōu)化[5-8]

2.2.1色譜柱的選擇

以乙腈-0.1%磷酸溶液（12:88）為流動(dòng)相，采用依利特Hypersil ODS-C18(5 μm,250 mm×4.60 mm)柱號(hào)：E1523089；Kromasil 100-5 C18 (5 μm,250 mm×4.60 mm)E 34067；SHIMADZU VP-ODS C18(5 μm,250 mm×4.60 mm)serial No.6122225三種色譜柱進(jìn)行測(cè)定。

2.2.2流動(dòng)相選擇

對(duì)流動(dòng)相甲醇-水（26:74）、甲醇-0.1%磷酸溶液（26:74）、乙腈-水（12:88）、乙腈-0.1%磷酸溶液（12:88）進(jìn)行檢測(cè)效果比較。

2.3 檢測(cè)方法考察

2.3.1線性關(guān)系考察

精密吸取馬錢苷對(duì)照品溶液（63.6 μg/mL）2 μL、5 μL、10 μL，馬錢苷對(duì)照品溶液（0.212 mg/mL）5 μL、10 μL、15 μL,注入液相色譜儀中，測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2精密度考察

進(jìn)樣精密度：取同一份供試品溶液 （批號(hào)：071211），連續(xù)進(jìn)樣6次每次20 μL。

重復(fù)性：取本品（批號(hào)：071211），共6份，按2.1.4進(jìn)樣量20 μL。

2.3.3準(zhǔn)確度（以回收率來標(biāo)定）

采用加樣回收試驗(yàn)，精密稱取7份已知含量（批號(hào)：071211，每g含馬錢苷0.831 mg）的耳聾左慈丸0.5 g，精密加入馬錢苷對(duì)照品液（0.01696 mg/mL）的80%甲醇溶液 （取馬錢苷對(duì)照品16.96 mg，置1000 mL量瓶，用80%甲醇溶解并稀釋至刻度，備用）各25 mL，按2.1.1項(xiàng)下制備，進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量20 μL測(cè)定峰面積。

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜條件優(yōu)化結(jié)果

3.1.1色譜柱選擇

色譜柱比較，采用不同廠家生產(chǎn)的C18色譜柱對(duì)同一份供試品溶液乙腈-0.1%磷酸溶液（12:88）流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)見表1。

表1 不同色譜柱分離效果的比較

主峰理論板數(shù)按馬錢苷峰計(jì)算不低于5000，由表1明顯看出Hypersil ODS C18柱要更好些。

3.1.2流動(dòng)相選擇

比較了甲醇-水（26:74）、甲醇-0.1%磷酸溶液（26:74）、乙腈-水（12:88）、乙腈-0.1%磷酸溶液（12:88），結(jié)果以乙腈-0.1%磷酸溶液（12:88）流動(dòng)相色譜峰形最好，故采用乙腈-0.1%磷酸溶液（12:88）為流動(dòng)相。

3.2 方法考察結(jié)果

3.2.1線性關(guān)系

精密吸取馬錢苷對(duì)照品溶液（63.6 μg/mL）2 μL、5 μL、10 μL，馬錢苷對(duì)照品溶液（0.212 mg/mL）5 μL、10 μL、15 μL,注入液相色譜儀中，進(jìn)樣量與峰面積的比值見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)結(jié)果

由表2的數(shù)據(jù)可以得標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=1624.2X+24.219，R2=0.9994，表明馬錢苷在0.1272～3.18 μg范圍內(nèi)，具有良好線性關(guān)系。

3.2.2精密度

取同一份供試品溶液（批號(hào)：071211），連續(xù)進(jìn)樣6次，按照色譜條件優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果表3。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

由表3可以發(fā)現(xiàn)，重復(fù)檢測(cè)6次，馬錢苷峰面積的RSD為0.4%(n=6)，RSD=0.4%，精密度良好。

重復(fù)性：取本品（批號(hào)：071211），共6份，按2.1. 1項(xiàng)下制備，按照色譜條件優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表4。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

由表4可以發(fā)現(xiàn)，重復(fù)檢測(cè)6份，結(jié)果測(cè)得馬錢苷平均含量為0.831 mg/g，RSD為0.5%，重現(xiàn)性良好。

3.2.3準(zhǔn)確度（以回收率標(biāo)定）

采用加樣回收試驗(yàn)，精密稱取7份已知含量（批號(hào)：071211，每克含馬錢苷0.831 mg）的耳聾左慈丸0.5 g，精密加入馬錢苷對(duì)照品液（0.01696 mg/mL）的80%甲醇溶液 （取馬錢苷對(duì)照品16.96 mg，置1000 mL量瓶，用80%甲醇溶解并稀釋至刻度，備用）各25 mL，按2.1.1項(xiàng)下制備，按照色譜條件優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行分析，按以下公式計(jì)算回收率，結(jié)果見表5。

表5 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

由表5可以發(fā)現(xiàn)，重復(fù)檢測(cè)6份，結(jié)果測(cè)得馬錢苷平均回收率為99.65%，RSD為0.5%，準(zhǔn)確度較好。

3.2.4穩(wěn)定性

取同一份供試品溶液（批號(hào)：071211），間隔一定時(shí)間分別進(jìn)樣，按照色譜條件優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表6。

表6 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

由表6的數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，在27 h內(nèi)，間隔一定時(shí)間，檢測(cè)7次，結(jié)果測(cè)得馬錢苷峰面積的RSD為0.7%(n=7)，表明供試品在27 h內(nèi)用該方法檢測(cè)基本穩(wěn)定。

4 總結(jié)

本研究建立了耳聾左慈丸中馬錢苷的含量測(cè)定方法,并從專屬性、重復(fù)性、準(zhǔn)確度、耐用性及穩(wěn)定性等方面進(jìn)行考察。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用Agilent 1100液相儀，以乙腈-0.1%磷酸溶液（12:88）流動(dòng)相柱溫20℃，檢測(cè)效果較好。利用該方法對(duì)杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司提供的幾批耳聾左慈丸中馬錢苷含量進(jìn)行測(cè)定，驗(yàn)證了該方法簡(jiǎn)便、快速,可作為耳聾左慈丸中馬錢苷的含量測(cè)定方法。

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Determination of Loganin in Erlong Zuoci Pills by HPLC

LU Xuan,ZHANG Xing-hai,HUANG Xue-mei
（The Department of Applied Engineering,Zhejiang Economic and Trade Polytechnic,Hangzhou 310018,China）

Objective:To develop an HPLC method for determination of loganin in Erlong Zuoci pills（traditional Chinese medicine）.Methods:The analysis was established by the Agilent 1100 HPLC,the flow rate was 1.0 mL·min-1,column temperature was 20℃ and detection wavelength was set at 240 nm;screening test conditions of loganin from the column type,types of mobile phase;from the linear range,recovery,precision, reproducibility and stability and so on to conduct investigations.Results:The calibration curve for loganin was linear within the range of 0.1272～3.18 μg(r2=0.9994),precision injection well(RSD=0.4%,n=6),a good sample reproducibility(RSD=0.5%,n=6),sample stability well(RSD=0.5%,n=6)and the recovery(n=62)of ferulic acid was 99.6% (RSD=0.5%);the determination was performed on an Hypersil ODS-C18column (250mm×4.60 mm,5μm)with a mobile phase of acetonitrile-0.1%phosphoric acid (V∶V=12∶88).Conclusions:The method is simple,accurate and reliable,specific,reproducible.

loganin;erlong zuoci pills;HPLC;quality analysis

1006-4184（2010）05-0029-03

2010-02-10

陸旋(1955-)，博士，從事生物資源利用研究。