食用菌液體母種純化技術

聶建軍，殷海善，李兆斌，王 錚

（山西省農業科學院農業資源綜合考察研究所，山西太原030006）

食用菌液體菌種是通過液體培養得到的食用菌菌種，簡單地講，是指生長在液體培養基中用于繁殖下一代的菌種或栽培菌絲體，即以菌絲體所存活培養基的存在形態來命名的[1]。

在菌絲體培養過程中，液體母種（液體培養的斜面母種）是食用菌液體培養的核心環節，菌種質量的好壞直接關系到食用菌栽培的成敗以及其產量的高低和質量的好壞。液體培養基由于培養條件與固體培養基有所不同，因此對菌種有其獨特的要求。液體培養基營養豐富，分布均勻，溫度、pH等條件適宜，細菌及其他雜菌在這樣的培養液條件下更易繁殖。通常細菌繁殖一代只需20～30 min，如果液體培養菌中進入一個細菌，繁殖15 h后，細菌數量可達到10億個[2]，這樣大量雜菌會造成所需制備的液體菌種染菌酸敗。但筆者在試驗中發現，帶有微量雜菌的菌種接到固體培養基上基本不影響菌種的萌發和吃料，接入菌瓶或菌袋仍能正常生長。

本研究采用木屑濾菌法和藥物濾菌法（木屑培養基中加0.5%多菌靈），對用于液體培養的斜面母種進行純化，以期達到液體培養的要求。

1 材料和方法

1.1 供試菌種

供試菌種為申香6號香菇（Lentinus edodes），引自上海市農業科學院。

1.2 菌種培養基

1.2.1 斜面母種PDA培養基 馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，水 1 000 mL，pH 自然[3]。

1.2.2 液體培養基 玉米粉6%，麩皮2%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，維生素 B110 mg/L，pH 自然[4]。

1.3 試驗方法

1.3.1 液體母種純化 將未純化菌種、木屑濾菌法純化菌種、藥物濾菌法純化菌種、木屑濾菌法和藥物濾菌法純化（高度純化）菌種分別接入PDA斜面試管，25℃下培養12 d。

1.3.2 接種與培養 250 mL三角瓶裝液體培養基40 mL，接入0.5 cm2等量菌塊3塊，使氣生菌絲一面向上懸浮，28℃靜置24h。然后放入往復式恒溫振蕩器內，28℃，150 r/min條件下培養4 d[5]。

1.4 測定方法

1.4.1 菌球數量測定 用吸管吸取1 mL菌液在玻璃板上攤成薄薄一層，用接種針將菌球分開，直觀計數，如此重復10次，取其平均值。

1.4.2 菌球直徑測定 培養結束后，隨機選取10個菌球排成一排，在玻璃板下襯坐標紙測量10個菌球直徑，重復3次，然后計算單個菌球的平均直徑。

2 結果與分析

2.1 不同純化方式菌種在斜面PDA培養基上的表現

取不同純化處理的菌種，每個接5支試管，25℃恒溫培養，3 d后開始測日平均生長速度，每隔3 d測1次，并觀察其長勢。

由表1可知，高度純化菌種日平均生長速度最快，達4.88 mm/d；藥物濾菌法次之，為4.62 mm/d，二者與未純化菌種之間差異極顯著。高度純化菌種與藥物濾菌法純化所得菌種之間差異達顯著水平，并且菌絲生長最旺盛，說明經高度純化的菌種活性最強[6]。

2.2 未純化和高度純化菌種對固體培養基和液體培養基污染率的影響

未純化和經過高度純化的PDA斜面母種分別在接種機前和超凈工作臺中接到固體鋸末為主料的原種瓶[7]和用250 mL容量三角瓶盛裝的液體培養基中，每種培養基接10個，每支PDA斜面母種分兩部分，1/2接固體培養基，1/2接液體培養基，25℃恒溫培養。

從表2可以看出，同樣的斜面菌種接到固體培養基上能夠正常生長，接到液體培養基上卻大比例染菌[8]，而經高度純化處理的菌種污染率極低，說明染菌與接種方式無關。由此可見，對用于液體菌種生產的普通斜面母種進行純化處理是相當必要的。

表1 菌絲生長速度多重比較（SSR法）和菌絲長勢

表2 不同純化方式對培養基的污染結果

2.3 未純化菌種與高度純化菌種在液體培養基中的表現

2種不同處理的菌種分別接入液體培養基中，28℃靜置24 h，然后在28℃，150 r/min條件下，恒溫振蕩培養4 d。

從表3可以看出，高度純化過的菌種接到液體培養基上比未純化的菌種具有萌發快、產生的菌球量大、菌球均勻一致而且不易沉淀等特點。

表3 不同純化方式菌種在液體培養基中的培養結果

3 結論

試驗表明，經過木屑濾菌法和藥物濾菌法純化的菌種較未純化菌種生長速度快，菌絲生長旺盛。經方差分析得出，二者之間差異極顯著。這對于其他菌種的活化具有借鑒意義。

采用木屑濾菌法和藥物濾菌法純化的菌種，去除了細菌和霉菌等雜菌的污染[9]，在液體培養時不僅污染率低，而且萌發快，產生的菌球量大，菌球均勻一致且不易沉淀，符合液體培養對菌種的特殊要求。

經過藥物濾菌法純化的菌種，活性比未純化菌種有明顯提高，這可能與培養基中的藥物刺激有關，但是否會對菌種的生物學特性有所改變、在實際生產栽培中對產量有無影響，還有待于進一步研究。

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