赤芍的高效液相指紋圖譜及液-質(zhì)聯(lián)用分析

王云濤， 王莉梅， 金向群

(吉林大學藥學院，吉林長春130021)

赤芍(以下簡寫為RPR)為毛茛科芍藥(Paeonia lactiflora Pall)或川赤芍(Paeonia veitchii Lynch.)的干燥根，主產(chǎn)于我國東北、華北、西北等地區(qū)。研究表明，其富含的各種單萜及苷類［1-3］成分，具有抗炎［4-5］、抗病毒［6］、免疫調(diào)節(jié)［7］、解痙、鎮(zhèn)靜、保肝［8］等作用，并對心血管系統(tǒng)［9］、婦科疾病［10］有一定的治療作用。鑒于赤芍藥效作用廣泛、成分多樣，宜選用指紋圖譜能夠較為全面、綜合地反映和控制其質(zhì)量。故本實驗采用RP-HPLC法建立赤芍的指紋圖譜，并采用HPLCMS聯(lián)用技術(shù)對赤芍的指紋圖譜進行研究，將HPLC對復雜樣品的高分離能力與MS的高選擇性、高靈敏度以及能夠提供分子量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點結(jié)合起來，可對赤芍質(zhì)量進行比較全面的評價［11］。

1 儀器與試藥

LC-10AT高效液相色譜儀(SHIMADZA);SPD-10A紫外檢測器(SHIMADZA);Diamonsil? C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)(大連中匯達科學儀器公司);芍藥苷標準品(購于中國藥品生物制品檢定所，0780-200004);赤芍藥材樣品(購于2007年9月，并經(jīng)吉林大學藥學院王廣樹教授鑒定)見表1。

2 方法和結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取在五氧化二磷減壓干燥器中干燥36 h的芍藥苷對照品適量，用甲醇制成0.58 mg/mL的溶液。0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取赤芍藥材2 g，加50%乙醇50 mL超聲30 min，用50%乙醇補足重量。取續(xù)濾液25 mL，蒸干，加甲醇溶解至10 mL量瓶中，稀釋至刻度，用0.45 μm微孔濾膜濾過，備用。

表1 赤芍藥材樣品來源Tab.1 Origins of RPR samples

2.3 色譜條件的確定 色譜柱為Diamonsil?C18(4.6 mm×250 mm，5μm)(大連中匯達科學儀器公司);流動相為A:乙腈，B:水，梯度洗脫:0 ～10 min(5%A)，10 ～20 min(10%A)，20～30 min(20%A)，30 ～40 min(20%A)，40 ～50 min(40%A)，50～60 min(5%A);流速1 mL/min;檢測波長231 nm;柱溫25℃;進樣量為5μL;分析時間為60 min。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取同一批的赤芍藥材，依照2.2項的方法配制成供試液。按選定的色譜條件連續(xù)進樣5次，進行測定。記錄各共有色譜峰的保留時間和積分面積。以芍藥苷的保留時間和積分面積為參照，計算出各共有峰的相對保留時間、相對積分面積及它們之間的RSD值，RSD均小于3%，符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》中關(guān)于用藥藥材指紋圖譜的規(guī)定。

2.4.2 重復性試驗 取同一批的赤芍藥材5份，分別依照2.2項的方法配制成供試液，進行測定并計算各共有色譜峰相對保留時間和相對峰面積及其RSD值，RSD值均不大于3%，都符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》規(guī)定，體現(xiàn)出色譜峰較好的一致性。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批的赤芍藥材，照2.2項的方法配制成供試液。按選定的色譜條件，分別在0、4、12、24、48 h進行測定。計算各共有色譜峰相對保留時間和相對峰面積及其RSD值，RSD值均小于3%，符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》中關(guān)于用藥藥材指紋圖譜的規(guī)定。

2.5 赤芍藥材HPLC指紋圖譜

2.5.1 指紋圖譜及共有指紋峰的標定 根據(jù)10批供試品HPLC圖譜所給出的相關(guān)參數(shù)可知，赤芍藥材所有成分的色譜峰在60min內(nèi)全部出現(xiàn)，所有譜峰都得到了較好的分離。以保留時間約為19.78 min的4號色譜峰作為參考峰(參考峰標號為S，其它特征峰依次以阿拉伯數(shù)字1，2，3…N進行標定)，計算10批樣品中有9個色譜峰的相對保留時間和相對峰面積比值，其值均較固定(統(tǒng)計結(jié)果見表2和表3)，故標定為共有指紋峰。見圖1和圖2。

圖1 赤芍藥材液相色譜圖Fig.1 HPLC analysis of RPR of different habitats

表2 10批赤芍藥材共有指紋峰相對保留時間計算結(jié)果Tab.2 Relative retention time of common peaks for 10 batches of RPR

表3 10批赤芍藥材共有指紋峰相對峰面積計算結(jié)果Tab.3 Relative areas of common peaks for 10 batches of RPR

圖2 赤芍藥材液相指紋圖Fig.2 HPLC fingerprint spectrum of RPR

2.5.2 指紋圖譜的相似度評價 本實驗采用Chromap Chromafinger V0.9軟件(珠海科曼中藥研究有限公司)對10批赤芍藥材進行數(shù)據(jù)處理，選樣品l色譜圖為對照，結(jié)果見表4，從相似度可以看出7個藥材的相似度都在0.930以上，只有3號藥材、4號藥材和5號的相似度較低。這是因為共有峰與對照譜圖的峰之間的這種差別而引起相似度偏低。結(jié)果表明，10個赤芍藥材可以分為2類:第1類相似度在0.9～1 之間，樣品有 1，2，6，7，8，9，10，可視為一類藥材，為赤芍樣品;第2類相似度在0.6～0.7之間，樣品有3，4，5，可視為一類藥材，為川赤芍。

表4 10批赤芍藥材的相似度Tab.4 Degree of sim ilarity of common peaks for RPR

2.6 赤芍藥材HPLC-MS定性研究 本實驗通過HPLC-MSESI正離子掃描獲得了赤芍指紋圖譜的一些結(jié)構(gòu)信息，對指紋圖譜中的部分色譜峰進行了結(jié)構(gòu)歸屬的初步判斷，結(jié)合文獻報道［12］，初步鑒定出5個指紋成分的化學結(jié)構(gòu)，見表5，其中芍藥苷通過與標準品對照HPLC保留時間得到確證。

表5 指紋圖譜各個峰可能歸屬Tab.5 Results of HPLC-MS analysis of RPR

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 檢測波長的選擇 利用DAD檢測器，對樣品進行全波長掃描，確定最佳檢測波長為231 nm。

3.1.2 流動相及洗脫方法的選擇 通過考察甲醇-0.2%磷酸、甲醇-水、乙腈-0.2%磷酸、乙腈-水等多種流動相，最終確定流動相為:乙腈-水，通過不同比例的乙腈-水對樣品洗脫能力的考察和摸索，本實驗最終采用不斷調(diào)節(jié)流動相比例和極性，并能達到最佳的分離效果的梯度洗脫作為實驗條件。

3.1.3 流速的選擇 本實驗考察了不同流速(0.6，0.8，1.0，1.5 mL/min)對色譜圖的影響，1.5 mL/min的流速分離效果差，0.6，0.8 mL/min的流速圖譜時間過長，1.0 mL/min的流速分離效果好且時間合適，符合指紋圖譜1 h的適宜時間，因此流速選擇1.0 mL/min。

3.2 樣品提取方法的選擇 本實驗分別采用超聲和回流提取方法，發(fā)現(xiàn)兩種方法所得組分相當，由于回流提取法較復雜，故本實驗采用超聲提取法。根據(jù)不同種醇在不同濃度時的提取結(jié)果，得出乙醇提取效率充分，且75%的乙醇提取效率最佳。最后確定樣品提取方法為75%乙醇超聲提取。

3.3 由于赤芍藥材的主要有效成分為一些單萜及各種苷類，中國藥典尤其以芍藥苷為分析對象，由于芍藥苷保留時間居中，且與周圍色譜峰的分離度較好，峰面積較大，故以之為參照物。

3.4 為了更有效地控制赤芍藥材的質(zhì)量，使其符合現(xiàn)代中藥研究及質(zhì)量控制要求，本實驗對該藥材建立了HPLC指紋圖譜，結(jié)果表明，這種方法穩(wěn)定、可靠并且簡便。同時充分體現(xiàn)其綜合化、宏觀化和可量化等優(yōu)于其他鑒別手段的優(yōu)勢，該法可用以對中藥材和中成藥進行真?zhèn)舞b別，評價原料藥材、半成品和成品質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性等。本實驗同時利用HPLC-MS等手段在獲得較多結(jié)構(gòu)信息的同時，對赤芍化學成分進行了初步定性分析，鑒定出5個化合物，可為赤芍化學成分的進一步研究及質(zhì)量控制提供參考。

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