基于AOTF-近紅外光譜技術的復方丹參片快速無損質量控制研究

武衛紅， 王 寧*， 石俊英， 董海平

(1.山東醫學高等?？茖W校，山東濟南250002;2.山東中醫藥大學，山東濟南250355;3.濟南金宏利實業有限公司，山東濟南250100)

復方丹參片是防治心腦血管疾病常用中成藥之一，2005版《中國藥典》分別采用薄層層析法和HPLC法對其進行定性、定量分析，對控制復方丹參片的質量發揮了積極的作用，但因檢測分析過程操作煩瑣，無法實施現場無損快速分析，使得在線質量控制及流通領域中假劣藥品的快速實驗篩查難以進行。另外，在臨床應用中發現，來自不同廠家的復方丹參片質量和療效存在很大差異［1］，這不僅與指標成分的含量差異有關，而且也和制劑中總成分的數和量有密切關系，有專家提出亟待完善現行藥典對復方丹參片的質量標準的問題［2］。因此，當前迫切需要一種快速、高效、適合現場檢測的新型分析測試技術來完善復方丹參片的質量檢測方法，進一步提高中成藥的檢測水平，加速中藥的現代化進程。

近紅外分析技術以其速度快、成本低、無損采樣的特點，近年來已成功應用于藥物分析領域［3-4］?！奥暪饪烧{濾光器(AOTF)”-第五代近紅外光譜儀因其具有便攜、環境適應性強、可用于現場快速分析等優勢在分析測試領域中已備受青睞［5］。國內，本研究團隊率先將此技術引入藥物分析領域中，獲得較滿意的研究結果［6-7］。本研究將AOTF-近紅外光譜技術引入到復方丹參片的定性定量分析中，實現了對復方丹參片的無損快速定性檢測和對丹酚酸B、丹參酮ⅡA、水浸出物、醇浸出物4項指標的同時、快速、無損定量分析。

1 材料與方法

1.1 儀器

美國BRIMROSE公司生產的Luminar 5030-731型便攜式AOTF技術近紅外光譜儀(主要部件:光學部分、電學控制部分、筆記本電腦;儀器波長范圍1 100 nm～2 300 nm，波長增量2 nm，掃描次數300，采用InGaAs檢測器)。挪威CAMO公司The Unscrambler分析軟件。高效液相色譜儀(Anglient 1200、DAD 檢測器)。

1.2 試藥

復方丹參片 收集北京同仁堂制藥廠、安徽華佗國藥廠等56個廠家共215個批號，定性分析取166個批號為校正集，32個批號為驗證集;定量分析取55個批號(來自5個大廠家)為樣本，其中5個批號為驗證集。

中成藥對照品 咳喘寧、通宣理肺片、三黃片、金鳴片、雙黃消炎片、消渴靈片、消炎片、抗骨增生片、小兒消食片、丹參片均購于濟南藥業集團。

丹酚酸B對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號111562-200504供含量測定用);丹參酮ⅡA對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110766-200417供含量測定用)。

1.3 化學方法測定樣本中丹參酮ⅡA、丹酚酸B、醇浸出物、水浸出物含量

按2005版《中國藥典》［8］復方丹參片項下含量測定方法，采用HPLC法測定55個樣品中丹參酮ⅡA和丹酚酸B含量。儀器方法學考察結果，丹參酮ⅡA精密度、穩定性、重復性RSD分別為0.22%，0.22%，0.99%，平均回收率 96.7%，RSD為1.02%;丹酚酸B精密度、穩定性、重復性RSD分別為2.58%，1.52%，1.25%，平均回收率96.6%，RSD為0.98%，均符合要求。每份樣品重復測定3次，相對偏差小于1.5%。

依照2005版《中國藥典》一部附錄XA中水浸出物、醇浸出物測定法，分別檢測55個樣本，每份樣品重復測定3次，相對偏差小于1.5%。

1.4 近紅外光譜采集

取不同批號樣品，將藥片分別置于出光孔位置，于1 100～2 300 nm波長范圍內進行漫反射掃描，波長增量2 nm，掃描平均次數為300次，每個批號樣品掃描10片，得到166個樣品的光譜圖，見圖1。

圖1 復方丹參片NIR吸收光譜圖Fig.1 Original NIR spectra of Compound Danshen Tablets

1.5 數據預處理與模型構建

對掃描得到的原始吸收光譜進行微分處理，可以消除基線漂移的影響，可分辨重疊峰，提高分辨率和靈敏度。但導數光譜法放大了相鄰波長點差異的同時也可能導致噪聲被放大，信噪比降低，經比較本研究采取一階微分處理光譜數據。

原始光譜信號的平滑處理是消除噪聲的常用方法，可有效平滑高頻噪音，提高信噪比。本研究選擇平滑數為9，可達到理想效果。

主成分回歸分析法(PCA)是一種多元分析方法，被廣泛應用在化學與測譜學分析中［9］，本研究利用該方法建立了片狀復方丹參片的定性分析模型，并對驗證集和對照品進行了驗證。偏最小二乘法(PLS)，交叉-驗證法(cross-validation)是 The Unscrambler定量分析軟件主要的數學處理方法，其特點為利用全部光譜信息，將高度相關的波長點歸于一個獨立變量中，根據為數不多的獨立變量建立回歸方程，通過內部交叉檢驗防止過度擬合［10］。本研究采用該方法建立片狀復方丹參片中4個參數的定量分析模型。

2 結果與討論

2.1 定性分析

2.1.1 PCA定性模型

166個校正集復方丹參片樣品的PC1、PC2主成分空間分布圖見圖2，圖中無明顯異常點，說明校正集樣本在一定區域內呈較均勻的分布。

圖2 校正集復方丹參片樣品的PC1、PC2主成分空間分布圖Fig.2 Score diagram of PC1 to PC2 of calibration set

2.1.2 定性分析模型驗證復方丹參片驗證集樣品

調用定性模型，對驗證集樣品進行預測，結果見圖3。軟件以兩種方法顯示結果，一是以表格顯示，二是模型區域判別顯示。左側表格中驗證集樣品編號后均有*號標記，說明它們屬于模型內樣品;模型區域圖中，驗證集樣品均落在模型區域內(圖中△號代表驗證集樣品，●號表示模型區域)，說明被檢測的樣品與建模樣品相同，被定性分析模型認可。

兩種顯示方法均表明被檢測的樣品屬于建模樣品， 即是復方丹參片。

圖3 定性模型對驗證集驗證結果Fig.3 Result of performance of qualitative model with Compound Danshen Tablets

2.1.3 定性分析模型驗證中成藥對照品

調用復方丹參片定性分析模型，驗證中成藥對照品，結果見圖4。圖中顯示，對照品編號后均無*號標記，說明10種中成藥均可被模型有效排除;模型區域圖中，對照品均沒有落在模型區域內，說明被檢測樣品與建模樣品不相同，即不是復方丹參片。

圖4 定性模型對中成藥對照品的驗證結果Fig.4 Result of performance of qualitative model with reference substance

以上結果表明，AOTF-近紅外光譜技術建立的復方丹參片片狀定性分析模型可對驗證集、對照品進行準確識別，因此，在實際工作中可直接對復方丹參片(薄膜衣)進行快速定性分析，本研究實現了對復方丹參片樣品的無損直接定性鑒別，為生產中無損快速檢測和商品流通中的打假工作提供了一種新的分析方法。

2.2 定量分析

2.2.1 PLS1數學模型

將經過預處理后的光譜數據與HPLC分析數據進行關聯，用The Unscrambler定量分析軟件采用PLS法，交叉-驗證法建立模型。NIR和HPLC測定的異常值分別采用光譜影響值Leverage和化學值誤差Residual兩個統計量來檢驗剔除，并根據NIR數學模型的主要參數內部交叉驗證決定系數(R2CV)、內部交叉驗證均方差(RMSECV)、外部驗證決定系數(R2Cal)、外部驗證均方差(RMSEP)確定最優模型。復方丹參片中丹參酮ⅡA、丹酚酸B、醇浸出物、水浸出物PLS1數學回歸模型參數見表1，表中參數顯示4個模型較為理想。

表1 PLS1數學回歸模型參數Tab.1 PLS1 regression model parameters

2.2.2 檢測模型效果

以PLS1建立的校正模型對5份外部驗證集樣品進行預測，再對預測值與化學值進行相關分析和顯著性t檢驗，結果見表2。從預測值與化學值之間的相關性看，醇浸出物的r值最好(0.898)，水浸出物r值最差(0.657)，但t顯著性檢驗表明丹參酮ⅡA、丹酚酸B、醇浸出物、水浸出物4個參數預測值與化學值之間差異并不顯著。

表2 PLS1回歸模型的驗證結果Tab.2 Results of prediction for external validation set by PLS1 regression model

2.2.3 精密度實驗

取1個預測樣品，重復掃描20次，將所得光譜帶入建立的校正模型計算含量，以考察方法的精密度，結果丹參酮ⅡA、丹酚酸B、醇浸出物、水浸出物的RSD值分別為3.62%，4.75%，2.22%，2.14%，說明儀器精密度良好。

2.2.4 穩定性實驗

取1個預測樣品，每1 h掃描1次，于5 h內重復掃描5次，考察樣品的穩定性。丹參酮ⅡA、丹酚酸B、醇浸出物、水浸出物的RSD值分別為1.73%，2.08%，3.32%，1.32%，，說明樣品在5 h內相對穩定。

以上結果表明，AOTF-NIR技術可以直接對復方丹參片進行掃描，建立4個指標的定量分析模型，不僅提高了效率，而且實現了對復方丹參片的無損定量分析。

3 結論

本研究在2005版《中國藥典》復方丹參片單純以指標成分為標準的基礎上，加強了對總成分的檢測，建立了復方丹參片中4個指標的同時快速定量分析方法。該方法更加符合中醫藥特點，既客觀反映了中藥內在物質基礎，又在宏觀上有效控制了中藥整體質量，使復方丹參片的質量控制更全面、更科學。

研究中采用Luminar 5030-731型便攜式聲光可調濾光器(AOTF)-近紅外(NIR)光譜儀，結合化學計量學方法，對復方丹參片直接掃描獲取光譜信息，分別建立定性定量分析模型，實現了對復方丹參片樣品的無損、直接快速分析，同時為其他中成藥的在線質量控制和適時快速質量評價提供了新思路。

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