針藥結合對乳腺增生大鼠血清及乳腺VEGF、bFGF含量的影響

段彥蒼， 杜惠蘭， 靳亞慈

(河北醫(yī)科大學中西醫(yī)結合學院，河北石家莊050091)

乳腺增生病隸屬于中醫(yī)學的“乳中結核”、“乳疬”等范疇。乳腺增生病在病理方面除了表現在上皮細胞、間質細胞、腺泡、導管等組織的增生外，亦存在著血管的增生［1］。目前血管內皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細胞生成因子(bFGF)被認為是乳腺癌特異性最強的兩種血管因子。我們推測乳腺增生中血管的生成可能與VEGF和bFGF密切相關。因此我們采用肌注外源性激素的方法復制乳腺增生大鼠模型，應用放免和免疫組織化學技術探討乳腺增生病變與血清、乳腺VEGF和bFGF的關系以及針藥協同作用對血清、乳腺VEGF和bFGF的調節(jié)治療機制。

材料和方法

1 動物

選用健康清潔級♀性Wistar大鼠60只，75～85日齡，體重(220±20)g，由河北醫(yī)科大學試驗動物中心提供，合格證號:602089。

2 藥物和試驗試劑

試驗所用中藥(柴胡、郁金、赤芍、白芍、川楝子、丹參、丹皮、橘核、王不留行、夏枯草、牡蠣、荔枝核、山慈菇)采用傳統的煎煮方法，過濾，離心，濃縮制成水煎液，每毫升約含生藥2.75 g，密封分裝，4℃放置備用。

苯甲酸雌二醇注射液、黃體酮注射液均由天津金耀氨基酸有限公司生產。枸櫞酸他莫昔芬由上海醫(yī)藥集團有限公司華聯制藥廠生產。

VEGF和bFGF酶聯免疫試劑盒，購于美國R-D公司。E2、P放免試劑盒購于美國DSL公司。PRL放免試劑盒購于天津九鼎醫(yī)學生物工程有限公司。

3 試驗方法

3.1 動物分組

綜上所述，Hp陰性萎縮性胃炎患者應用替普瑞酮治療的臨床效果更加顯著，不僅可以減輕胃黏膜病變程度，改善臨床癥狀，還可以減少不良反應的發(fā)生。

大鼠適應性喂養(yǎng)2周后，按隨機數字表法將其分為6組，每組10只:即正常組、模型組、模型+針刺組(簡稱“針刺組”)、模型+中藥組(簡稱“中藥組”)、模型+針刺+中藥組(簡稱“針藥組”)、模型+TAM陽性對照組(簡稱“對照組”)。

3.2 復制模型

除正常組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)外，其余組參照張璐［2］等造模方法，大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/(kg/d)，連續(xù)25 d，然后注射黃體酮5 mg/(kg/d)，連續(xù)5 d，建立大鼠乳腺增生模型。

3.3 治療方法

從第31天開始，各組分別治療。針刺組:根據《中國獸醫(yī)針灸學》結合人體穴位，選取屋翳、合谷、膻中、足三里，每日1次，9次為一療程，療程間休息1 d，共30 d。中藥組:按25g/(kg/d)灌服中藥，30 d。針藥組:針刺操作同針刺組，同時灌服中藥，劑量同中藥組，30 d。對照組:TAM 1.9 mg/(kg/d)，相當于臨床等效劑量，30 d。正常組和模型組灌服同體積蒸餾水，30 d。

4 標本制備和檢測方法

末次治療5 h后，用游標卡尺測量第2對乳房的直徑。斷頭取血，制備血清，置－70℃保存，用放射免疫法測定血清E2、P和PRL含量，酶聯免疫法測定血清VEGF和bFGF含量。切取第2對乳房，甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片(4 μm)，免疫組織化學染色(按ABC試劑盒操作指南進行)。

美國IPP(Image-proplus)分析軟件對免疫組化染色切片進行圖像分析，每個切片采集5個視野，得出度量物質含量信息的灰度等級，將所得灰度值取平均數作為統計指標。平均灰度與陽性表達強弱成反比，灰度值越小，陽性染色越強，蛋白表達越多。

所有數據用均數±標準差表示。用SPSS12.0統計軟件進行統計處理，對所測定結果進行正態(tài)性及方差齊性檢驗，組間比較用單因素方差分析，檢驗以P<0.05為有統計學意義。

結果

1 大鼠乳頭直徑的變化(見表1)

乳腺增生模型組大鼠的乳頭豎起，較堅實，充血，增高2～3 mm。正常組的乳頭形態(tài)與試驗開始時一樣，隔毛看不見乳頭位置，將毛分開后，僅見乳頭呈小米樣，緊貼在皮膚上，蒼白、柔軟、個別稍隆起1 mm左右。針刺組、中藥組、對照組和針藥組乳頭直徑均減小，其中對照組和針藥組乳頭直徑明顯減小，與模型組相比有顯著性差異。

表1 各組大鼠乳頭的直徑變化比較(±s)

表1 各組大鼠乳頭的直徑變化比較(±s)

注:與正常組比較*P<0.05，**P<0.01;與模型組比較ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

組別 動物數/只 乳頭直徑/μm正常組10 1.085±0.064模型組 10 1.311±0.063**針刺組 10 1.251±0.038**Δ中藥組 10 1.253±0.055**Δ針藥組 10 1.186±0.051**ΔΔ對照組 10 1.215±0.032**ΔΔ

2 血清生殖激素變化(見表2)

治療后與模型組相比，針刺組和中藥組大鼠血清E2水平降低(P<0.05)，針藥組和對照組大鼠血清E2水平明顯降低(P<0.01);針藥組血清 PRL含量水平降低(P<0.05);針藥組血清中P的含量升高(P<0.01)，和正常組無統計學差異。

表2 各組大鼠血清E2、P、PRL變化比較(±s)

表2 各組大鼠血清E2、P、PRL變化比較(±s)

注:與正常組比較*P<0.05，**P<0.01;與模型組比較ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

組別 動物數/只 E2/(pg/mL) P/(ng/mL) PRL/(ng/mL)正常組10 15.238±8.218 57.047±17.014 7.947±1.459模型組 10 36.864±20.599**31.571±5.821** 9.912±4.206*針刺組 10 22.974±12.067Δ 43.492±18.742 8.349±1.202中藥組 10 21.191±16.587Δ 45.362±20.310 8.363±1.049針藥組 10 15.759±10.912ΔΔ 55.311±18.727ΔΔ 7.987±1.188Δ對照組 10 19.257±13.439ΔΔ35.402±14.929**8.217±0.735

3 血清VEGF、bFGF的變化(見表3)

與正常組相比，模型組大鼠血清中VEGF和bFGF的含量明顯升高，其它組含量均降低，尤其針藥組降低明顯(P<0.01)。

表3 各組大鼠血清VEGF、bFGF的變化比較(±s)

表3 各組大鼠血清VEGF、bFGF的變化比較(±s)

注:與正常組比較*P<0.05，**P<0.01;與模型組比較ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

組別 動物數/只 VEGF/(pg/mL) bFGF/(pg/mL)正常組10 16.414±3.798 244.370±57.431模型組 10 21.357±4.816** 507.900±79.051**針刺組 10 20.114±5.501* 446.375±73.120**中藥組 10 18.117±2.735 444.440±65.137**Δ針藥組 10 15.400±2.285ΔΔ 406.350±55.675**ΔΔ對照組 10 17.239±2.978Δ 264.010±78.394ΔΔ

4 乳腺組織VEGF、bFGF的表達

VEGF、bFGF的陽性表達定位于細胞漿內，為棕黃色染色。與正常組相比，模型組大鼠乳腺組織中VEGF、bFGF的表達增強(P<0.01)。治療后，針刺組、中藥組和針藥組VEGF、bFGF的表達均明顯低于模型組(均P<0.01);對照組與模型組比較有降低的趨勢，但兩組之間比較無統計學意義(P>0.05)。(表 4、圖 1，2)

表4 各組大鼠VEGF、bFGF表達平均灰度比較(±s)

表4 各組大鼠VEGF、bFGF表達平均灰度比較(±s)

注:與正常組比較*P<0.05;**P<0.01;與模型組比較ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

組別 動物數/只VEGF bFGF正常組10 84.76±8.30 102.00±4.90模型組 10 62.89±8.05** 77.61±5.08**針刺組 10 71.09±6.28**ΔΔ 86.24±3.30**ΔΔ中藥組 10 75.13±2.80**ΔΔ 87.29±5.24**ΔΔ針藥組 10 88.25±6.57ΔΔ 100.05±8.42ΔΔ對照組 10 64.96±7.24** 80.45±4.95**

討論

乳腺增生是女性常見病，多數學者認為乳腺增生病的發(fā)生與內分泌紊亂、卵巢功能失調造成體內長時間的P不足、E2絕對或相對增多有關。乳腺增生病被認為是乳腺癌癌前的一種良性病變，血管增生在乳腺腫瘤的生長過程中起到了重要作用。VEGF在健康成人組織中維持正常的血管密度和基本的滲透功能，以利于營養(yǎng)物質的運輸，但表達水平極低，是機體內皮細胞特異性的分裂原和血管增生因子，對血管生成和血管通透性增加有重要的調節(jié)功能［3］。VEGF通過刺激血管新生促進腫瘤細胞的生長和轉移，是目前所知的作用最強，選擇性最高的內皮細胞絲裂原，是腫瘤血管生成過程中的重要調節(jié)因子［4］。VEGF及其受體通過旁分泌途徑聯合調控內皮細胞分化、血管生成［5］;又通過自分泌調節(jié)功能協調其功能的完成。在血管形成的調控中，bFGF起著關鍵作用。bFGF能促進表皮、內皮細胞再生，促進血管內皮細胞分裂，誘導其從基膜中分離出來，以刺激內皮細胞向腫瘤組織趨化運動，并形成管狀結構，還可提高組織中血纖維蛋白溶解酶原激活因子類(PAs)，誘導內皮細胞產生其他蛋白酶，是血管形成較為直接的誘導物質。bFGF亦能通過自分泌和旁分泌形式促進腫瘤的生長與轉移［6］。

圖1 VEGF在各組乳腺的表達(×200)

圖2 bFGF在各組乳腺的表達(×200)

在乳腺增生模型大鼠的血清中，存在著VEGF和bFGF的高含量，在局部組織中存在著VEGF和bFGF的高表達，我們認為在乳腺增生模型大鼠中存在著血管增生，乳房局部已經存在微循環(huán)障礙。VEGF和bFGF可能通過一定的途徑被激活后，通過某種共同的機制促使乳腺組織局部的增生。針藥結合可能通過下調VEGF和bFGF，減少病變區(qū)域的血流信號，加快血流速度，以改善乳腺組織的微循環(huán)、改變乳腺組織的血管數目和形狀，從而達到治療目的。同時提示我們針藥結合的治療方法，與單純服用中藥、單純應用針灸以及西藥三苯氧胺(TAM)相比較，療效顯著，作用廣泛。這為中醫(yī)藥干預治療乳腺增生病提供了實驗依據。

［1］劉勝春，吳凱南，歷江元.血管生成在乳腺非典型增生及癌變過程中的作用［J］.中國腫瘤臨床，1998，23(6):421-424.

［2］張 璐，烏蘭·格日樂，喬國芬，等.中藥乳腺丸對鼠乳腺增生的影響［J］.中國中西醫(yī)結合外科雜志，2003，9(1):39-41.

［3］Kroll J，Waltenberger J.Regulation of the endothelial function and angiogenesis by vascular endothelial growth factor-A(VEGF-A)［J］.Z Kardiol，2000;89(3):206-218.

［4］Ferra N.Vascular endothelial growth factor:molecular and biological aspects［J］.Curr Top Microbiol Immunol，1999;237:1-30.

［5］Gerwins P，Sloidenberg E，Claesson W L.Function of fibroblast growth fact and VEGF and their receptors in angiogenesis［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2000;34(3):185-194.

［6］易文君，唐中華，楊竹林，等.青年和絕經女性乳腺癌VEGF、bFGF及其受體表達的差異［J］.中華腫瘤雜志，2003，25(2):141-144.