乙型腦炎病毒(JEV)ELISA檢測(cè)方法的建立

王 吉，衛(wèi) 禮，鞏 薇，高正琴，岳秉飛，賀爭(zhēng)鳴

(中國藥品生物制品檢定所，國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物、遺傳檢測(cè)中心，北京 100050)

乙型腦炎病毒(JEV)ELISA檢測(cè)方法的建立

王 吉，衛(wèi) 禮，鞏 薇，高正琴，岳秉飛，賀爭(zhēng)鳴

(中國藥品生物制品檢定所，國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物、遺傳檢測(cè)中心，北京 100050)

目的 建立豬乙型腦炎病毒(JEV)抗體ELISA檢測(cè)方法。方法 培養(yǎng)BHK21細(xì)胞，接種JEV病毒，制備BHK21正常抗原和JEV特異抗原，滴定酶結(jié)合物和抗原最佳工作濃度，并進(jìn)行精密性、敏感性、穩(wěn)定性、特異性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 正常、特異抗原和酶結(jié)合物最佳工作濃度分別為0.2 μg/mL、10 μg/mL和1∶20000;正常、特異抗原批內(nèi)變異系數(shù)分別為8.3%和6.4%，批間平均變異系數(shù)分別為9.7%和11.5%;檢測(cè)靈敏度為1∶1280;與豬瘟病毒(CSFV)、豬細(xì)小病毒(PPV)均無交叉反應(yīng)。穩(wěn)定性試驗(yàn)相對(duì)偏差小于25%。結(jié)論 建立的ELISA方法重復(fù)性、穩(wěn)定性好，特異性、敏感性強(qiáng)。可用于豬JEV抗體的檢測(cè)。

乙型腦炎病毒;ELISA

乙型腦炎(Japanese encephalitis，JE)又稱日本腦炎，是由黃病毒科(Flaviridea)黃病毒(flavivirus)乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一種人畜共患自然疫源性疾病，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害為主的急性傳染病。豬是本病的主要傳染源，能引起懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，公豬發(fā)生睪丸炎。該病在大多數(shù)養(yǎng)豬場(chǎng)呈地方性流行，陽性率達(dá)20%～30%。人感染后死亡率達(dá)30%以上，另外有50%會(huì)留下神經(jīng)系統(tǒng)方面的后遺癥，目前還沒有人感染JEV后完全治愈的報(bào)道［1－2］。

近年來隨著生物醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，小型豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)用越來越廣泛。而乙型腦炎病毒對(duì)小型豬也同樣會(huì)構(gòu)成嚴(yán)重的威脅，對(duì)飼養(yǎng)人員和實(shí)驗(yàn)人員也存在著潛在的危險(xiǎn)性。為保證小型豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量和使用的安全性，有必要對(duì)其進(jìn)行乙腦的檢測(cè)。我國現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中沒有對(duì)實(shí)驗(yàn)用小型豬乙型腦炎病毒的檢測(cè)做出相應(yīng)的規(guī)定。本實(shí)驗(yàn)旨在建立靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便的ELISA方法，對(duì)JEV抗體進(jìn)行檢測(cè)，為推動(dòng)了實(shí)驗(yàn)用小型豬標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程及中國實(shí)驗(yàn)用小型豬的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)［3］。

1 材料和方法

1.1 主要材料

JEV毒種(Nakayama-NIH)、無 JEV抗體牛血清:由本所疫苗一室提供;BHK21細(xì)胞:本室凍存;山羊抗豬IgG-HRP:KPL公司產(chǎn)品;豬標(biāo)準(zhǔn)陰、陽對(duì)照血清:中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)診斷室提供;JEV ELISA檢測(cè)試劑盒:北京索奧生物技術(shù)有限公司和深圳市綠詩緣生物技術(shù)有限公司;血清來源:某小型豬飼養(yǎng)場(chǎng)。

1.2 主要儀器

酶標(biāo)儀:Thermo Multiskan MK3;熒光顯微鏡:Olypus IX;37℃水浴箱:上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司DK-4500B型;37℃培養(yǎng)箱:WGP-600。

1.3 方法

1.3.1 病毒感染力滴度(TCID50)測(cè)定:將病毒液以10－1～10－11作系列倍比稀釋，依次加入培養(yǎng)有BHK21細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(costor)(1～11列)，每個(gè)稀釋度接種1列(8孔)，第12列不加病毒，作為細(xì)胞對(duì)照。置37℃培養(yǎng)觀察10 d，記錄結(jié)果。

1.3.2 抗原的制備及純化:正常抗原:BHK21細(xì)胞長(zhǎng)成單層，常規(guī)法消化，PBS洗滌，1 000 r/min離心10 min，沉淀溶于適量PBS凍融3次后，超聲破碎，10 000 r/min離心 30 min，取上清液，并測(cè)蛋白含量。

特異抗原:收獲 JEV細(xì)胞毒于4℃，10 000 r/min離心1 h，取上清于4℃，40 000 r/min離心3 h，收集沉淀于適量PBS中。再經(jīng)20%蔗糖離心后，用紫外分光光度法測(cè)定抗原蛋白含量。

1.3.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定:依據(jù)國標(biāo)選擇A490來讀取吸光度。在陰、陽對(duì)照成立的情況下，待檢血清特異抗原孔A值≥0.2、待檢血清特異抗原孔A值/陰性對(duì)照特異抗原孔A值≥2.1，判為陽性［5］。

1.3.4 正常抗原與特異抗原、酶結(jié)合物最佳工作濃度的確定:將陰、陽對(duì)照血清和備檢血清1∶40稀釋［4］。正常抗原分別以 0.05、0.1、0.2、0.4 μg/mL進(jìn)行包被，特異抗原分別以5、10、20 μg/mL進(jìn)行包被，羊抗豬 IgG-HRP以 1∶5 000～1∶64 000倍比稀釋，通過方陣來確定正常、特異抗原和酶結(jié)合物最佳工作濃度［5］。

1.3.5 特異性試驗(yàn):(1)玻片免疫熒光試驗(yàn):接種JEV的單層BHK21細(xì)胞，病變達(dá)80%～90%時(shí)滴片，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。標(biāo)準(zhǔn) JEV陰、陽血清1∶10稀釋［6］，進(jìn)行玻片免疫熒光試驗(yàn)。(2)用已建立的ELISA法分別檢測(cè)豬瘟(CSFV)和豬細(xì)小病毒(PPV)、標(biāo)準(zhǔn)陰、陽血清。同時(shí)設(shè) JEV標(biāo)準(zhǔn)陰、陽血清對(duì)照。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn):將4℃放置0、30和90 d的3個(gè)不同批次抗原包被板，同時(shí)檢測(cè)已知4份陰性和4份陽性血清，計(jì)算 A490變化率(相對(duì)偏差)，確定ELISA 法的時(shí)間穩(wěn)定性［8］。

1.3.7 精密性試驗(yàn):同一份陽性血清的同一稀釋度用同一批板同時(shí)做 20孔，計(jì)算 A490的變異系數(shù)［7］。

將4℃放置0、30、60和90 d的4個(gè)不同批次抗原包被板，同時(shí)檢測(cè)不同抗體水平的同8份陽性血清和同8份陰性血清，進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn)，計(jì)算批間變異系數(shù)［7］。

1.3.8 靈敏性試驗(yàn):JEV抗體陽性血清從1:40開始作系列倍比稀釋，用建立的ELISA法進(jìn)行檢測(cè)，最大稀釋比例陽性孔(A490≥0.2)為其檢測(cè)靈敏度［7］。

1.3.9 可信度:用建立的ELISA方法，對(duì)應(yīng)用商品化ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)過的已知陰、陽血清60份進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證此方法的可信度［7］。

2 結(jié)果

2.1 病毒感染力滴度

TCID50為 10－10.25/mL。

2.2 BHK21正常抗原蛋白含量為:1.6789 mg/mL;特異抗原JEV蛋白含量為5.3125 mg/mL。

2.3 正常、特異抗原和羊抗豬 IgG-HRP最佳工作濃度分別為 0.2、10 μg/mL 和 1∶20 000。

2.4 特異性實(shí)驗(yàn)

(1)免疫熒光試驗(yàn)

JEV陰性血清與病毒感染細(xì)胞和正常細(xì)胞均無綠色熒光反應(yīng);JEV陽性血清與正常細(xì)胞無熒光反應(yīng)，與病毒感染細(xì)胞呈強(qiáng)綠色熒光反應(yīng)(圖1和圖2，見彩插 3)。

(2)在JEV陰、陽對(duì)照均成立的條件下，與豬瘟(CSFV)和豬細(xì)小(PPV)病毒陰、陽血清均無特異性反應(yīng)。

2.5 穩(wěn)定性

8份血清的 A值變化率(相對(duì)偏差)均小于25%。

2.6 精密性

正常、特異抗原批內(nèi)的變異系數(shù)(CV)分別為8.3%和6.4%;正常、特異抗原批間平均變異系數(shù)(CV)分別為9.7%和11.5%。

2.7 靈敏度

間接ELISA實(shí)驗(yàn)靈敏度測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 間接ELISA實(shí)驗(yàn)靈敏度測(cè)定結(jié)果(A490)Tab.1 The sensitivity of the ELISA detection method

2.8 應(yīng)用

ELISA方法檢測(cè)已知陰、陽血清結(jié)果見表2。

表2 ELISA方法檢測(cè)已知陰、陽血清結(jié)果Tab.2 Detection results of negative and positive sera with the ELISA technique

46份陰性血清檢測(cè)出3份陽性，43份陰性，陰性血清檢測(cè)符合率為93.5%;6份陽性血清檢測(cè)結(jié)果均為陽性，陽性符合率為100%;8份可疑血清中，檢測(cè)出7份陽性，1份陰性。

3 討論

本試驗(yàn)用BHK21細(xì)胞培養(yǎng)JEV全病毒作抗原，雖經(jīng)過蔗糖純化，但也會(huì)存在細(xì)胞類等非特異性物質(zhì)，為排除細(xì)胞類等物質(zhì)可能引起的非特異性反應(yīng)，同時(shí)用處理過的BHK21細(xì)胞作正常抗原做對(duì)照，可以有效排除非特異性反應(yīng)而造成的假陽性，提高了檢測(cè)結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確性。

ELISA方法批內(nèi)變異系數(shù)都小于10%，批間平均變異系數(shù)都小于15%，說明精密性良好;靈敏度達(dá)到1∶1280，說明敏感性很強(qiáng);免疫熒光試驗(yàn)證明ELISA所用JEV抗原的特異性很強(qiáng);而且與豬瘟和豬細(xì)小病毒均無交叉反應(yīng)［8］。

本試驗(yàn)開始用建立的檢測(cè)方法檢測(cè)已知60份血清，結(jié)果顯示，抗體陽性率幾乎為100%，后用經(jīng)檢測(cè)無JEV抗體牛血清配制的稀釋液，作為待檢血清和酶的稀釋液，檢測(cè)結(jié)果為陽性血清16份，陰性血清44份，陽性率為26.7%，與文獻(xiàn)報(bào)道豬JEV感染率為 20%～30% 相符［1］。

可信度試驗(yàn)中，已知6份陽性血清檢測(cè)結(jié)果均為陽性;8份可疑血清中，有7份陽性，1份陰性;46份陰性血清中，有3份陽性，43份陰性。說明本試驗(yàn)建立的ELISA方法檢測(cè)敏感性更高。

建議在制定實(shí)驗(yàn)用小型豬飼養(yǎng)管理標(biāo)準(zhǔn)方面，希望能對(duì)小型豬進(jìn)行JEV疫苗免疫接種，以保證飼養(yǎng)人員及實(shí)驗(yàn)人員的健康與生命安全。而且希望能在今后的工作中，對(duì)疫苗接種免疫后小型豬的抗體變化規(guī)律進(jìn)行摸索和研究，為小型豬JEV檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供可靠的數(shù)據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)建立的 ELISA方法，具有操作簡(jiǎn)便、快速、敏感性好、特異性強(qiáng)、檢測(cè)準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)［8］，為今后小型豬JEV檢測(cè)工作和ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的研制及實(shí)驗(yàn)用小型豬的質(zhì)量控制及標(biāo)準(zhǔn)化奠定了基礎(chǔ)。

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Establishment of an ELISA Technique in Detecting Japanese Encephalitis Virus Antibody

WANG Ji，WEI Li，GONG Wei，GAO Zheng-qin，YUE Bing-fei，HE Zheng-ming
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biology Products，National Center for Microbiological and Genetic Monitoring of Laboratory Animals，Beijing 100050，China)

Objective To establish an ELISA detection method for Japanese encephalitis virus(JEV)antibody.Methods BHK21cells were cultured and JEV virus was vaccinated.The normal BHK21antigen and JEV-specific antigen were prepared.The optimal working concentration of enzyme conjugate and the normal or specific antigens were titrated，and the accuracy，sensitivity，stability and specificity were tested.Result The best working concentrations of normal and specific antigens and the enzyme conjugate were 0.2 μg/mL，10 μg/mL and 1 ∶20000，respectively.The intra-assay coefficient of variation of normal antigen and special antigen was 8.3%and 6.4%，and the inter-assay average coefficient of variation was 9.7%and 11.5%，respectively.The detection sensitivity was 1∶1280.There was no cross-reactivity with classical swine fever virus(CSFV)and porcine parvovirus(PPV).The stability test showed a relative deviation less than 25%.Conclusion The established ELISA method has good reproductivity，stability，specificity and sensitivity，and can be used in detection of pig JEV antibody.

JEV;ELISA;Detection，method

R-33

A

1671-7856(2010)08-0056-04

2010-03-16

圖1 JEV陽性血清與正常BHK21細(xì)胞反應(yīng)
Fig.1 Normal BHK21 cells

圖2 JEV陽性血清與JEV感染BHK21細(xì)胞反應(yīng)
Fig.2 JEV-infected BHK21 cells

“國家科技支撐計(jì)劃”:動(dòng)物源性生物材料病毒安全性檢測(cè)技術(shù)研究(2008BAI54B06)。

王吉(1974-)，女，助理研究員，研究方向:微生物學(xué)和免疫學(xué)。

賀爭(zhēng)鳴(1957－)，男，研究員，博士，研究方向:微生物學(xué)和免疫學(xué)。E-mail:zhengminghe57@163.com