不同鼠齡的人多巴胺D5F173L突變基因轉(zhuǎn)基因高血壓小鼠血壓及心臟結(jié)構(gòu)與功能分析

董 偉，楊志偉，曹興水，姚 璐，張 旭，高 珊，張海濤，張連峰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100021)

不同鼠齡的人多巴胺D5F173L突變基因轉(zhuǎn)基因高血壓小鼠血壓及心臟結(jié)構(gòu)與功能分析

董 偉，楊志偉，曹興水，姚 璐，張 旭，高 珊，張海濤，張連峰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100021)

目的 通過對不同年齡多巴胺D5F173L突變基因及D5正常基因轉(zhuǎn)基因小鼠的血壓和心臟結(jié)構(gòu)與功能進行分析，了解多巴胺D5受體在高血壓發(fā)生發(fā)展過程中的作用。方法 利用無創(chuàng)血壓測量儀和高分辨率小動物超聲系統(tǒng)檢測兩種轉(zhuǎn)基因小鼠的血壓和左心室壁厚度、左心室內(nèi)徑、左心室容積、射血分數(shù)、短軸縮短率和左心室質(zhì)量等心臟功能指標。結(jié)果 D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠4月齡、6月齡、16月齡時收縮壓、舒張壓都明顯高于D5轉(zhuǎn)基因小鼠;4月齡、6月齡的D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠與D5轉(zhuǎn)基因小鼠相比舒張期和收縮期左室壁厚度均明顯增大、左室內(nèi)容積均明顯變小、左心室重量增加;16月齡的D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠與D5轉(zhuǎn)基因小鼠相比左心室前壁增厚、心腔內(nèi)徑縮短，心腔容積下降、心室重量增加、射血分數(shù)提高、短軸縮短率提高;在18月齡時D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠相比于D5轉(zhuǎn)基因小鼠左心室收縮期前壁厚度增加，后壁厚度減少，舒張期前壁厚度增加，后壁厚度減少;另外在18月齡時D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠與其16月齡時相比，射血分數(shù)、短軸縮短率明顯降低，收縮期左心室容積明顯增大。結(jié)論 D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠的血壓及心臟功能與結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果符合原發(fā)性高血壓的特征。D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠可作為原發(fā)性高血壓動物模型。

高血壓;多巴胺D5受體;心臟超聲;小鼠，轉(zhuǎn)基因

原發(fā)性高血壓(primary hypertension)及其并發(fā)癥是影響人類健康的主要原因之一。過去20～30年的研究發(fā)現(xiàn)，多巴胺在調(diào)節(jié)鈉排泄及血壓方面具有重要的作用［1-3］。多巴胺(dopamine)是通過多巴胺受體(dopamine receptor)發(fā)揮其功能的，多巴胺受體為一種G蛋白偶聯(lián)受體，分為D1類和D2類亞家族受體。D1類受體包括D1和D5受體(在大鼠中又被稱為 D1A和 D1B)，刺激腺苷酸環(huán)化酶活性、增加cAMP的產(chǎn)生;而D2類受體包括 D2、D3和 D4受體，則抑制腺苷酸環(huán)化酶活［4］。D5受體對多巴胺有較強的親和力，且在沒有多巴胺的情況下，仍發(fā)揮功能，即自身具有持續(xù)活性，因此D5受體對高血壓發(fā)病的作用更為重要［5］。研究還發(fā)現(xiàn) D5受體基因位點(chromosome 4P15.1-16.1)與原發(fā)性高血壓有相關(guān)性［6-9］。人D5受體基因多態(tài)性能引發(fā)功能異常的，包括 L88F、F173L、A269V、P330Q、C335X、N351D、S390G和 S453G［10］。我們建立了人多巴胺D5F173L突變基因及D5轉(zhuǎn)基因小鼠［11］。本文主要探討多巴胺D5受體突變基因在不同年齡對小鼠血壓和心臟結(jié)構(gòu)與功能的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗分為兩組，第一組轉(zhuǎn)人多巴胺受體D5突變基因D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠，簡稱D5F173L;第二組轉(zhuǎn)人多巴胺受體 D5野生型 D5轉(zhuǎn)基因小鼠，簡稱 D5。每組小鼠各6只，雌雄各半，由實驗動物研究所遺傳中心提供［SCXK京2009-0008］。

1.2 血壓測量

在4月齡、6月齡和16月齡對兩組實驗鼠進行血壓測量。使用Softron智能無創(chuàng)血壓計BP-98A測量血壓，選擇與小鼠大小合適的鼠袋，鼠網(wǎng)，將小鼠頭部朝前，前端朝上放入鼠袋，包緊小鼠臀部將鼠尾露出;將小鼠于38℃溫桶中預(yù)熱10 min，然后將加壓感應(yīng)器正確置于尾根處;保持小鼠在安靜和清醒狀態(tài)下數(shù)秒后開始測量小鼠血壓;每只小鼠測量3次，記錄3次平均值為測量結(jié)果。

1.3 超聲分析

在4月齡、6月齡、16月齡、18月齡對兩組實驗鼠進行心臟超聲檢測。實驗小鼠用三溴乙醇注射麻醉后(0.18 mL/10 g體重)，用脫毛劑脫去胸部體毛，置于檢測臺上，將臺溫設(shè)定為40℃，小鼠四肢用醫(yī)用膠布固定于涂有導(dǎo)電膠的電極上，記錄生理指標。用VisualSonics Vevo770操作系統(tǒng)和專門用于小鼠心臟的RMV707B高頻超聲探頭，進行B型、M型超聲，血流多普勒的檢測。通過 VisualSonics Vevo770高分辨率小動物超聲系統(tǒng)的軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 D5F173L突變基因轉(zhuǎn)基因小鼠高血壓可持續(xù)到老年

血壓測量結(jié)果顯示，在4月齡、6月齡、16月齡三個時間點，D5F173L收縮壓較D5分別高7.2%(P＜0.05)、11.7%(P ＜0.05)、8.9%(P ＜0.05)(圖1A);D5F173L舒張壓較 D5分別高16.2%(P＜0.05)、8.9%(P ＜ 0.05)、22%(P ＜0.05)(圖1B)。

2.2 D5F173L突變基因表達影響基因轉(zhuǎn)基因小鼠心臟結(jié)構(gòu)

超聲檢測結(jié)果顯示，在4月齡、6月齡、16月齡、18月齡4個時間點，D5F173L的收縮期左心室前壁較D5分別增厚 2.3%(P＞0.05)、9.5%(P＜0.05)(圖 2)、14.5%(P ＜0.05)、14.3%(P ＜0.05)，收縮期左心室后壁分別增厚82%(P＜0.01)、75%(P＜0.01)(圖 2)、15.7%(P ＜0.05)、-12%(P ＜0.05)，舒張期左心室前壁分別增厚 1.1%(P＞0.05)、19.3%(P ＜0.05)(圖 2)、1.0%(P ＞0.05)、18.3%(P＜0.05)，舒張期左心室后壁分別增厚91%(P ＜0.05)、105%(P ＜0.05)(圖 2)、1.1%(P＞0.05)、-16.28%(P＜0.05)(圖 3A);D5F173L的收縮期左心室容積較D5分別縮小53.7%(P＜0.05)、85.3%(P ＜0.01)、30.4%(P ＜0.05)、11%(P＞0.05)(圖3B);D5F173L的收縮期左心室內(nèi)徑較D5分別縮短 26.2%(P＜0.01)、53%(P＜0.01)(圖 2)、15.9%(P ＜0.05)、3.4%(P ＞0.05)(圖3C);D5F173L的左心室重量較D5分別增加34%(P＜0.05)、26.8%(P ＜0.05)、6.3%(P ＞0.05)、5.4%(P＞0.05)(圖3D)。

2.3 D5F173L突變基因表達影響基因轉(zhuǎn)基因小鼠心臟功能

在心臟功能方面D5F173L的短軸縮短率較D5分別增加 30.2%(P＜0.05)、38.8%(P＜0.01)、30.4%(P＜0.05)、1.6%(P＞0.05)(圖 4A);D5F173L的射血分數(shù)較 D5分別增加 8.8%(P＞0.05)、20.1%(P ＜0.05)、11.3%(P ＜ 0.05)、1.2%(P＞0.05)(圖 4B)。在 18月齡時 D5F173L與其16月齡時相比，射血分數(shù)降低17.9(P＜0.05)、短軸縮短率降低27.0%(P＜0.05)(圖5A)，收縮期左心室容積增大24.6%(P＜0.05)(圖5B)。

圖1 不同年齡小鼠血壓的測定Fig.1 Determination of the blood pressure of the transgenic mice at different ages

圖2 M型超聲測量小鼠左心室壁厚及心室內(nèi)徑Fig.2 Determination of the left ventricular wall thickness and ventricular diameter using M-mode ultrasonography

3 討論

高血壓是多種心血管疾病的重要危險因素之一，心臟作為靶器官之一與其存在著密切的關(guān)系。左心室肥厚(left ventricular hypertrophy，LVH)是高血壓病早期最常見的心臟改變。高血壓病的發(fā)展過程中，心臟為了克服持續(xù)性增高的外周阻力，以維持足夠的心搏出量，心室肌收縮力必須相應(yīng)增加，從而發(fā)生心肌細胞代償性增大、細胞間質(zhì)水腫、膠原纖維增生等，隨著病程進展，心肌纖維化導(dǎo)致心肌僵硬度的增加，最終導(dǎo)致心臟構(gòu)型和功能的改變，即心室重塑(ventricular remodeling)。這些變化始發(fā)于心肌損傷、壓力超負荷及容量超負荷改變［12］。這些結(jié)構(gòu)變化的初始目的是保持有效的心功能，但長時間后則是有害的，最終導(dǎo)致心力衰竭［13］。高血壓代償性左室肥厚呈對稱性的向心性肥厚，室壁和室間隔增厚，心室容積和室壁張力基本正常，重量體積比增高。晚期演變?yōu)殡x心性肥厚，心腔擴大，左室球狀改變，心功能衰竭［12］。

D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠4月齡、6月齡、16月齡時，收縮壓與舒張壓都明顯高于 D5轉(zhuǎn)基因小鼠，表明多巴胺D5F173L突變使其對血壓的調(diào)節(jié)功能減弱，壓力超負荷狀態(tài)持續(xù)存在。4月齡、6月齡的D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠與D5轉(zhuǎn)基因小鼠相比舒張期和收縮期左室壁厚度均明顯增大、左室內(nèi)容積均明顯變小、左心室重量增加，射血分數(shù)和短軸縮短率增加并且上述變化有隨時間漸進的趨勢，表明血壓升高同時伴有左室心肌肥大、室腔減小、進行性增重呈現(xiàn)向心性肥厚及為了對抗壓力超負荷狀態(tài)心肌收縮功能增強，心功能提升等代償性改變。16月齡的D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠與D5轉(zhuǎn)基因小鼠相比左心室前壁增厚、心腔內(nèi)徑縮短，心腔容積下降、心室重量增加、射血分數(shù)提高、短軸縮短率提高提示心臟仍處于代償期，但是與 4、6月齡的心功能分析結(jié)果比較，D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠相比于D5轉(zhuǎn)基因小鼠在上述各項數(shù)據(jù)上均出現(xiàn)降低趨勢，表明D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠心臟已經(jīng)出現(xiàn)失代償?shù)内厔荨Ｔ?8月齡時D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠相比于D5轉(zhuǎn)基因小鼠左心室收縮期前壁厚度增加，后壁厚度減少，舒張期前壁厚度增加，后壁厚度減少，其余各項數(shù)據(jù)均無明顯差異，且與上述指標變化無明顯相關(guān)性;另外在18月齡時D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠與其16月齡時相比射血分數(shù)、短軸縮短率明顯降低，收縮期左心室容積明顯增大，提示D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠的左室肥厚呈非對稱性，心腔擴大，心功能下降，出現(xiàn)失代償表型。

圖3 M型超聲測量轉(zhuǎn)基因小鼠心臟結(jié)構(gòu)變化Fig.3 Determination of the cardiac structural changes in the transgenic mice by M-mode ultrasonography

圖4 轉(zhuǎn)基因小鼠心臟功能分析Fig.4 Comparison of the heart function of 4-month-old，6-month-old，16-month-old and 18-month-old D5F173Land D5 transgenic mice

圖5 轉(zhuǎn)基因小鼠心臟功能分析Fig.5 Cardiac function analysis of the transgenic mice

綜上，D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠的血壓及心臟功能與結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果符合原發(fā)性高血壓的特征，D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠可以作為原發(fā)性高血壓小鼠模型，用于研究高血壓引起的左心室肥厚。

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Analysis of the Blood Pressure and Cardiac Structure and Function in Human Dopamine D5F173LTransgenic Mice at Different Ages

DONG Wei，YANG Zhi-wei，CAO Xing-shui，YAO Lu，ZHANG Xu，GAO Shan，ZHANG Hai-tao，ZHANG Lian-feng
(Institute of Laboratory Animal Science，Peking Union Medical College/Chinese Academy of Medical Sciences，Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health，Beijing 100021，China)

Objective To analyze the role of D5F173Lmutation in the development of hypertension，and to detect the blood pressure，cardiac structure and function changes in the D5F173Lmutation gene and the D5 gene transgenic mice at different ages.Methods The blood pressure was detected with an intelligent non-invasive blood pressure measuring instrument(SoftronTM).The cardiac structure and function were examined with a high-resolution small animal ultrasound system(Sonics Vevo770).Results Both systolic and diastolic blood pressures of the D5F173Ltransgenic mice were significantly higher than that in the 4-month，6-month and 16-month old D5 transgenic mice.Compared with the 4-month and 6-month old D5 transgenic mice，the ventricular wall thickness and ventricular mass of the D5F173Ltransgenic mice wasincreased，while the left ventricular volume decreased.Compared with the D5 transgenic mice at the age of 16 months，the left ventricular wall thickness，cardiac chamber diameter shortening and cardiac chamber volume in the D5F173Ltransgenic mice were decreased，while the ventricular weight，ejection fraction and fractional shortening rate were increased.The D5F173Ltransgenic mice showed an obvious remodeling compared to 18-month old D5 transgenic mice，with a decease of the left ventricular systolic anterior wall and posterior wall，and increase of the diastolic wall.Conclusion The changes of blood pressure，cardiac function and cardiac remodeling of the D5F173Ltransgenic mice show a similar phenotype with that of human primary hypertension.The D5F173Ltransgenic mouse can be used as a primary hypertension animal model.

Hypertension;Dopamine D5 receptor;Echocardiography;Transgenic mice

R331.1

A

1671-7856(2010)08-0001-05

2009-12-22

衛(wèi)生部項目，實驗動物和人類疾病動物模型資源擴展(200802036)和十一五新藥專項支持(2009ZX09501-026)。

董偉，男，電話：010-87778442。

張連峰，E-mail： Zhanglf@cnilas.org。