反相高效液相色譜法測定青蒿中青蒿酸的含量

孫景燦,曾建立,趙 兵,袁曉凡,王曉東

1中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室,北京 100190;2中國科學院研究生院,北京 100049

反相高效液相色譜法測定青蒿中青蒿酸的含量

孫景燦1,2,曾建立1,2,趙 兵1＊,袁曉凡1,王曉東1

1中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室,北京 100190;2中國科學院研究生院,北京 100049

本文建立了反相高效液相色譜快速測定青蒿中青蒿酸含量的方法。色譜條件為:Diamonsil C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm,5μm),柱溫為 (30±1)℃,流動相采用乙腈與 0.2%磷酸水溶液混合液 (體積比 65:35),流速 1 mL/min,檢測波長 220 nm。標準曲線回歸方程:Y=8.784573×10-8X-6.443559×10-5,r=0.9997,青蒿酸回收率為 102.4%。實驗證明該方法穩定可靠、精密度高、重現性好、簡單可行,適用于青蒿酸的分析檢測。

青蒿;青蒿素;前體;青蒿酸;反相高效液相色譜

從青蒿 (Artem isia annuaL.)中提取分離的青蒿素作為最有效的抗瘧藥物已得到世界公認,而且隨著青蒿素新用途的不斷發現,其資源需求量將越來越大,但不少青蒿中青蒿素含量低 (≤0.3%),無法用于提取青蒿素。研究發現青蒿中青蒿素含量和青蒿酸含量呈相反規律,如山西廣靈產的青蒿中青蒿素含量為 0.1%左右,而青蒿酸的含量達到 0.5%,是青蒿素含量的 5倍[1]。青蒿酸 (Artemisinic acid)最早是由中科院上海藥物所鄧定安等從山東產青蒿丙酮提取物中分離得到,并分析了其結構和性質[2]。青蒿酸是一種倍半萜類化合物,無色方形晶體,分子式為 C15H22O2,分子中含有一個羧基,顯弱酸性,能溶于NaHCO3溶液和石油醚、丙酮及醇類等有機溶劑[2,3]。在青蒿素合成代謝途徑中,青蒿酸是青蒿素合成的重要前體物質之一[4,5]。雖然青蒿酸也具有一定的抗瘧疾活性,但其活性遠低于青蒿素[6],因此青蒿酸的利用一直未能引起重視。青蒿酸不僅可以作為青蒿素合成前體,還具有抗腫瘤等多種活性[7],我國低青蒿素含量的青蒿資源分布廣泛、產量巨大,具有青蒿酸生產的原料優勢。

在青蒿酸提取、分離和轉化成青蒿素的過程中,需要對青蒿酸含量變化進行準確和快速的檢測。目前有關青蒿酸的分析檢測都是以青蒿素為主要分析對象的前提下進行,而青蒿酸與青蒿素同時檢測時,需要采用特殊的檢測器,分析時間大大延長。如在HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS同時分析檢測青蒿素、青蒿酸和青蒿乙素的方法中,就需要使用電噴射電離-四極時間飛行器與質譜進行樣品處理和檢測,分析過程復雜[8],在 HPLC-UV-ELSD的檢測方法中需同時使用紫外和蒸發光散射兩種檢測器,分析時間長達 40 min左右[1]。因此,研究建立青蒿酸快速準確檢測方法對低青蒿素含量青蒿資源的利用和青蒿酸的開發均具有重要意義。

本文針對青蒿酸建立了 RP-HPLC-UV的分析檢測方法,該方法不需要特殊的設備,而且分析方法穩定性好、精密度高、時間短、過程簡單,可以作為青蒿酸定量分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

島津LC-20 AT高效液相色譜儀 (日本島津公司),包括 SPD-M20A二級管陣列檢測器、S IL-20A自動進樣器、LCsolution液相色譜工作站;8002型恒溫水浴控制器(余姚明偉儀表廠);RE-52AA旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠);TDL-5-A型低速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.2 試劑與藥品

不同產地青蒿、青蒿酸對照品 (中國中醫科學院中藥研究所,純度 98%);乙腈 (Fisher公司)、無水甲醇 (Fisher公司)為色譜純;磷酸 (北京化學試劑公司)、無水乙醇 (天津市福晨化學試劑廠)均為分析純。

1.3 色譜條件

Diamonsil C18色譜柱 (250 mm ×460 mm,5 μm),流動相為乙腈和 0.2%磷酸水溶液,等梯度洗脫,兩相體積比為 65:35,分析時間為 25 min,流速為 1 mL/min,進樣量為 10μL,檢測波長為 220 nm,柱溫為 (30±1)℃。

1.4 標準溶液配制

精確稱取青蒿酸對照品 3.25 mg,用無水甲醇溶解并定容至 50 mL,得到濃度為 0.0650 mg/mL的標準溶液備用。在 2.3所述色譜條件下分析得到青蒿酸對照品的 HPLC色譜圖如圖 1所示,青蒿酸保留時間為 20.56 min。

圖 1 青蒿酸對照品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of artemisinic acid reference substance

1.5 樣品制備

取 1 g粒度為 80目的青蒿原料,放于 100 mL具塞三角瓶中,加入 50 mL無水乙醇浸泡 1 h,超聲提取 3次,每次 30 min,離心取上清得到青蒿提取液。進樣前用 0.22μm的微孔膜過濾,按 2.3所述HPLC色譜條件分析,色譜圖如圖 2所示,樣品溶液中的青蒿酸出峰時間 20.60 min,與圖 1中青蒿酸對照品出峰時間一致。

圖 2 青蒿酸樣品溶液 HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of artemisinic acid sample solution

2 結果

2.1 檢測波長選擇

圖 3是青蒿酸對照品在 190～400 nm之間的全波長掃描圖,由圖可知青蒿酸在 195 nm處有最大紫外吸收。在這個波長下,洗脫劑中乙腈和甲醇的吸收也很強(乙腈的最大吸收波長 190 nm,甲醇為 205 nm),如果波長選定為195 nm,洗脫劑的會對青蒿酸檢測產生影響;但是乙腈和甲醇在 220 nm處紫外吸收較弱,而青蒿酸在 220 nm下的吸收較強,所以選擇 220 nm為檢測波長。

圖 3 青蒿酸對照品在 190～400 nm間的紫外吸收光譜圖Fig.3 Ultraviolet absorption spectrogram (190-400 nm)of artemisinic acid reference substance

2.2 流動相選擇

與甲醇相比,乙腈對青蒿酸的洗脫能力更強,與水混合后產生的柱壓也更低,所以選擇乙腈為洗脫溶劑。但是僅使用乙腈與水的混合液為洗脫溶劑時,色譜峰有拖尾現象,為改良峰形,避免拖尾,選擇0.2%磷酸水溶液作為洗脫緩沖溶液。

圖 4為不同流動相配比條件下的色譜圖,A、B、C、D中上部分為青蒿酸對照品的色譜圖,下部分為提取液樣品的色譜圖。如圖所示,當乙腈-磷酸緩沖溶液配比為 55∶45和 60∶40時,目標峰與雜質峰可以分開,但峰的純度較低,且保留時間過長 (圖 4A、4B);提高有機相濃度可縮短保留時間,當乙腈-磷酸緩沖溶液配比調整為 70∶30時,洗脫能力較強,保留時間縮短,但是青蒿酸與其他雜質的峰重合,無法分開(圖 4C);進一步調整乙腈-磷酸緩沖溶液配比為 65∶35時,目標物質峰可與雜質峰分開,峰形較好,純度較高,且出峰較快 (見圖 4D),故選擇洗脫溶劑配比為 65∶35。

圖 4 不同流動相配比條件下青蒿酸對照品溶液和樣品溶液色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of artemisinic acid reference substance solution and sample solution with different mobile phase ratios

2.3 流速選擇

圖 5是樣品在不同洗脫流速(A、B、C、D依次為0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min)下的色譜圖。當流速為0.6 mL/min和 0.8 mL/min時,保留時間分別為 35. 94 min(5A)和 25.84 min;提高流速,可以縮短分析時間,當流速提高到 1.2 mL/min時,青蒿酸在 17. 40 min即可出峰(5D),但是此時,柱壓升高,會影響色譜柱壽命;綜合考慮 1.0 mL/min(5C)的流速比較適宜,出峰較快,峰形也好。

2.4 標準曲線及檢出限的測定

分別取 2.4中所制備的青蒿酸對照品溶液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mL加入 5 mL容量瓶定容,得到青蒿酸濃度分別為 0.0026、0.0078、0.0130、0.0182、0.0234 mg/mL的 5個對照品溶液。進樣10 μL進行檢測,記錄數據并以峰面積為(X)為橫坐標,樣品濃度 (Y)為縱坐標,繪制標準曲線,如圖 6所示。回歸方程為Y=8.784573×10-8X-6.443559 ×10-5,相關系數r=0.9997。最低檢出限為 1.7 μg/mL(S/N=3)。

圖 5 青蒿酸樣品溶液在不同洗脫劑流速下的色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of artemisinic acid sample solution in different flow rates

圖 6 青蒿酸標準曲線Fig.6 Calibration curve of artemisinic acid

2.5 穩定性的測定

取濃度為 0.0338 mg/mL的標準溶液,每 2 h測一次,12次測定峰面積結果見表 1,相對標準偏差為RSD=0.25%,表明該方法在 24 h內穩定性。

2.6 精密度的測定

取濃度為 0.0338 mg/mL的標準溶液重復檢測 5次,實驗結果見表 2,峰面積 RS D值為 0.28%,保留時間的RS D值為0.26%,表明該方法檢測精密度較高。

2.7 重現性的測定

按照 2.5中所述方法制備 5份供試液,分別在同樣的色譜條件下測定青蒿酸含量,分析數據見表3,計算 RSD值為 1.96%,表明該方法重現性較好。

表 1 檢測方法穩定性試驗數據Table 1 Test data of the detection method’s stability

表 2 檢測方法精密度試驗數據Table 2 Test data of the detection method’s precision

表 5 不同產地青蒿中青蒿酸的含量Table 5 Artemisinic acid content inA rtem isia annuaL.grown in different places

表 3 檢測方法重現性試驗數據Table 3 Test data of the detection method’s repeatability

2.8 加標回收率的測定

精確稱取同一批已知青蒿酸含量的樣品 0.05 g,共 6份,加入適量濃度為 0.6055 mg/mL的對照品溶液,按照 2.5中制備樣品溶液的方法進行提取準備待測液,按照上述色譜分析方法分析檢測,計算回收率(表 4),RSD為 1.97%(n=6)。

表 4 加標回收率實驗Table 4 Standard addition recovery test

2.9 樣品的測定

分別以貴州遵義、重慶酉陽以及湖南三個產地的青蒿為原料,按照 2.5所述方法制備青蒿酸樣品溶液,采用上述反相高效液相色譜方法進行檢測,檢測結果見表 5,5個樣品中青蒿酸含量最高可達到1.4 mg/g,可以用來生產青蒿酸從而充分利用青蒿資源。

3 總結

本文建立了反相高效液相色譜檢測青蒿酸的方法,選擇反相 C18柱,以乙腈-0.2%磷酸水溶液為流動相(體積比 65∶35),在 30℃的溫度下于 220 nm處檢測。檢測結果表明:該方法具有良好的穩定性、重現性及精密度,青蒿酸保留時間顯著縮短,可以用于青蒿中青蒿酸的快速檢測。

青蒿酸具有重要研究開發價值,用于青蒿酸提取的青蒿資源豐富。本文建立的反相高效液相色譜法可以快速準確地檢測青蒿酸含量,可以為青蒿資源有效利用和青蒿酸研究開發奠定基礎。

1 ZhangD(張東),YangL(楊嵐),YangLX(楊立新),et al. Determination of artemisinin,arteannuin B and artemisinic acid in herbaA rtem isiae annuaeby HPLC-UV-ELSD.Acta Phar m Sin(藥學學報),2007,42:978-981.

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Determ ination of Artem isin ic acid inA rtem isia annuaL.by RP-HPLC

SUN Jing-can1,2,ZENG Jian-li1,2,ZHAO Bing1＊,YUAN Xiao-fan1,WANG Xiao-dong1

1National Key laboratory of B iochem ical Engineering,Institute of Process Engineering,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,China;2Graduate University of Chinese Academ y of Sciences,Beijing 100049,China

A method for detecting the content of artemisinic acid which is the key precursor of artemisinin inA rtem isia annuaL.by RP-HPLC was established.Itwas carried out in a Diamonsil C18column(250 mm ×4.6 mm,5μm)at (30±1)℃.Acetonitrile combinedwith 0.2%phosphoric acid aqueous solution(65:35,V/V)was used as the mobile phase at a flow rate of 1 mL/min,and the detection wavelength was 220 nm.The calibration curve equation wasY= 8.784573×10-8X-6.443559×10-5(r=0.9997).A recovery rate of 102.4%was achieved.The results proved that thismethed was suitable for detecting artemisinic acid with good stability,high precision,strong reproducibility,and simple operation.

A rtem isia annuaL.;artemisinin;precursor;artemisinic acid;RP-HPLC

R284.1;Q946.91

A

1001-6880(2010)05-0846-05

2009-01-09 接受日期:2009-03-18

國家高技術研究發展計劃(863)基金 (2007AA021501)

＊通訊作者 Tel:86-10-82627059;E-mail:bzhao@home.ipe.ac.cn