單棕櫚酰莽草酸的高效液相色譜-蒸發光散射檢測法定量測定

孫 陽,湯魯宏＊

江南大學醫藥學院生物制藥系,無錫 214122

單棕櫚酰莽草酸的高效液相色譜-蒸發光散射檢測法定量測定

孫 陽,湯魯宏＊

江南大學醫藥學院生物制藥系,無錫 214122

本文建立一種采用高效液相色譜 -蒸發光散射檢測法定量測定單棕櫚酰莽草酸的方法。色譜條件:色譜柱:反相 Symmetry C18柱 4.6×250 mm i.d.(填料粒度 5μm),柱溫 30℃,流動相:乙腈 -水 -甲酸 (80∶20∶0.2);流速 0.8 mL/min;ELSD漂移管溫度:80℃,載氣流速:2 L/min。3-,4-和 5-棕櫚酰莽草酸純品采用酶法合成,合成產物經柱層析和高效液相色譜制備純化得到純品。在該色譜條件下,3-,4-和 5-棕櫚酰莽草酸在 0.21～4.12μg的范圍內,其質量與其峰面積線性關系良好(r=0.9991,0.9998,0.9997),回收率分別為 95.2～98.7%, 96.1%～98.2%,96.3%～98.5%;RS D分別為1.6%,1.8%,1.9%。實驗結果表明該方法具有簡便、快速、準確、重現性較好的特點,可以用于定量分析單棕櫚酰莽草酸,尤其適用于非水相酶促反應合成體系中的產物檢測。

單棕櫚酰莽草酸;莽草酸;定量測定;HPLC;ELSD

單棕櫚酰莽草酸 (Monopa lmityloxy Shikimic Acid,m-PSA),包括 3-,4-和 5-棕櫚酰莽草酸 (3-,4-和 5-PSA,結構見圖 1),是一類化學新單體 (ChemicalNew Entity),屬脂溶性莽草酸類衍生物。

莽草酸 (Shikimic Acid,結構見圖 1)是一種從中藥木蘭科植物八角茴香中提取的具有生理活性的天然產物[1],有抗血栓和減輕局灶性腦缺血損傷的作用,同時也是抗 H5N1型禽流感特效藥“達菲”合成原料。馬怡等[2]報道 SA對二磷酸腺苷 (ADP)誘導大腦中動脈栓塞(MCAT)模型大鼠的血小板聚集率有較強的抑制作用;靜注和肌注 SA均使小鼠血凝時間延長。

莽草酸具有極性大,親水性好 (在水中的溶解度能達到 180 g/L)等理化性質,導致莽草酸難以透過血腦屏障,生物利用度不高,嚴重影響了治療效果。

單棕櫚酰莽草酸的合成提供了一種脂溶性莽草酸新品種[3]。關于單棕櫚酰莽草酸的分析檢測,目前已經建立了 TLC定性分析方法,定量分析方法的建立迄今作者未見國內外有任何報道。

本文采用反相高效液相色譜-蒸發光散射檢測法(RP-HPLC-ELSD)建立了一種簡便、快速、準確、重現性較好的單棕櫚酰莽草酸定量分析方法。

圖 1 莽草酸,3-棕櫚酰莽草酸,4-棕櫚酰莽草酸和 5-棕櫚酰莽草酸的結構Fig.1 Structures of Shikimic acid(SA),3-Monopalmityloxy shikimic acid(3-PSA),4-Monopalmityloxy shikimic acid(4-PSA)and,5-Monopalmityloxy shikimic acid(5-PSA)and their corresponding calculated log P(calculated by ChemSketch)

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

HPLC:Agilent 1100高效液相色譜儀;檢測器: Alltech蒸發光散射檢測器 2000;HPLC-MS:色譜儀: Waters 2695;檢測器:Waters 996;色譜柱:Sunfire C18柱 2.1×150 mm i.d(填料粒度 5μm);柱溫∶35℃;流動相:甲醇-水-甲酸 (80∶20∶0.2);流速為 0.3 mL/min;檢測波長 210nm;質譜儀:Waters Z MD4000;離子源:ESI電離源,電噴霧離子化負離子采集模式 (ESI-),m/z范圍:200～800 amu,離子源溫度:103℃,脫溶劑氣溫度:300℃,脫溶劑氣流量:280 L/h,毛細管電壓:3.5 kV,錐孔電壓:25 V。UN ITY INOVA 400核磁共振儀。

莽草酸 (純度 ＞99%,HPLC,購自陜西華騰公司),棕櫚酸 (分析純,中國醫藥上海化學試劑站),甲醇,正己烷,氯仿,乙醚,乙酸乙酯,甲酸 (分析純),高碘酸溶液,0.5%(w/v),亞硫酸鈉-氫氧化鈉溶液 (亞硫酸鈉溶液為 0.0555 mol/L,氫氧化鈉溶液為 1 mol/L,氫氧化鈉和亞硫酸鈉的混合液體積比為 3∶2)。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品的制備

于 250 mL具塞三角瓶中加入無水叔戊醇 100 mL,莽草酸 1 g,棕櫚酸 11 g。封口后于 55℃恒溫水浴振蕩器中振蕩 (150 r/min)平衡 30 min,加入0.1 g固定化脂肪酶 Novozeme 435,反應 32 h,反應結束后過濾除去固定化酶和分子篩。高碘酸顯色薄層定性檢測單酰化物的存在。所用硅膠 G薄層板規格為 20 cm×10 cm×0.2 cm,展開劑為氯仿-甲醇-正己烷-甲酸(體積比為 5∶1∶1∶0.1),顯色劑為高碘酸溶液 0.5%(w/v),亞硫酸鈉-氫氧化鈉溶液 (亞硫酸鈉溶液為 0.0555 mol/L,氫氧化鈉溶液為 1 mol/L,氫氧化鈉和亞硫酸鈉的混合液體積比為 3∶2)。在該薄層色譜條件下,各組分的比移值Rf為∶莽草酸 0.17,單酰化物 0.5,棕櫚酸 0.63。

將除去固定化酶和分子篩的反應液旋轉蒸干,用正己烷配制成濃度為 1 g/mL,在一根 40×500 mm具塞砂芯過濾層析柱中上樣、正己烷 2個柱體積,乙醚 2個柱體積 (此時上樣固體幾乎消失),氯仿-甲醇(5∶1)3個柱體積,甲醇 1個柱體積作為流動相,依次洗脫,回收氯仿-甲醇收集液溶劑,得預純化的單棕櫚酰莽草酸。

原料進行預純化濃縮蒸干后,將所得預純化產物配成甲醇濃溶液,取3 mL進行制備分離。以甲醇∶水∶甲酸 (85∶15∶0.2)為洗脫液恒流洗脫。205 nm,210 nm雙通道紫外檢測,分別收集三個單峰。旋轉蒸發除去溶劑,常溫下真空干燥 12 h,得到三種組分,然后用高效液相色譜,質譜,氫核磁共振譜分析制備得到的組分的結構,得出三種組分為 3,4,5位分別酰化的單棕櫚酰莽草酸。

分別精確稱取 3-,4-和 5-棕櫚酰莽草酸 1.27, 1.10,1.13 mg溶于 10 mL甲醇,得到 3-,4-和 5-棕櫚酰莽草酸濃度分別為 0.127,0.11,0.113 mg/mL的標準溶液。

1.2.2 樣品的制備

在合成反應進行中分別于反應 0,2.5,3.5, 4.5,5.5,6.5,8,9.5,11,12.5,14,16,23,27,32 h取樣,過濾除去分子篩、固定化脂肪酶及不溶底物,得樣品溶液,供測定。

1.2.3 色譜條件

色譜柱:SymmetryC18柱 4.6×250 mm i.d(填料粒度 5μm);柱溫:30℃;流動相:乙腈-水-甲酸 (80∶20∶0.2);流速為 0.8 mL/min;ELSD漂移管溫度為:80℃,載氣流速:2 L/min。

2 結果與討論

2.1 3-,4-和 5-棕櫚酰莽草酸的結構分析

將制備得到的三種組分分別經 HPLC,MS分析,結果如圖 2,3。經質譜電噴霧負離子檢測,其準分子離子質荷比均為 411-,符合單棕櫚酰莽草酸分子量(412)。經 1H NMR分析,可進一步確定高效液相色譜制備得到的 1號峰為 4-PSA,2號峰為 3-PSA,3號峰為 5-PSA。

1號峰 (4-PSA1H NMR)δ:12.417(s,1 H), 6.613(d,1 H),5.167(s,1 H),5.119(t,1 H), 4.821(m,1 H),4.387(s,1 H),3.93(t,1 H), 2.397(d,1 H),2.302(t,2 H),2.131(d,1 H), 1.497(m,2 H),1.234(m,24 H),0.869(t,3 H)。2號峰(3-PSA1H NMR)δ:12.483(s,1 H),6.468 (d,1 H),5.424(s,1 H),5.051(s,1 H),5.026(t, 1 H),3.851(t,1 H),3.761(m,1 H),2.502(d,1 H),2.327(t,2 H),2.119(d,1 H),1.538(m,2 H),1.237(m,24 H),0.853(t,3 H)。3號峰 (5-PSA1H NMR)δ:12.422(s,1 H),6.632(d,1 H), 5.004(s,1 H),4.991(m,1 H),4.963(t,1 H), 4.172(s,1 H),3.672(t,1 H),2.671(d,1 H), 2.288(t,2 H),2.132(d,1 H),1.494(m,2 H), 1.234(m,24 H),0.869(t,3 H)。

2.2 色譜條件選擇

合成原料中棕櫚酸、莽草酸以及單棕櫚酰莽草酸對紫外光吸收較弱,僅在低波長處有點吸收,采用紫外檢測器進行檢測時,響應信號較弱,特別是棕櫚酸難以檢測到,且低波長檢測受流動相影響較大,如果溶劑質量不高,背景噪音較大,檢測靈敏度更低。如果采用示差折光檢測器進行檢測時,檢測靈敏度也很低,難以達到量較低時的檢測要求,為此,我們采用了蒸發光散射檢測器進行檢測,取得了理想的效果。

圖2 制備樣品的HPLC圖譜Fig.2 HPLC of components separated by preparative HPLC

圖 3 制備樣品的質譜圖Fig.3 MS spectra of components separated by preparative HPLC

有關單酰化莽草酸的檢測分析,國內外尚未見有研究報道。我們試驗了多種品牌的 C18色譜柱,發現 Symmetry C18(4.6×250 mm i.d,填料粒度 5μm)色譜柱在分離度及分析時間上優于其他色譜柱。然后用此色譜柱對流動相進行了優化,由于分析目標物都具有酸基,所以在流動性中添加一定量的酸來改善峰型,試驗了乙腈-水-甲酸、甲醇-水-甲酸、乙腈-水-乙酸、甲醇-水-乙酸等梯度洗脫條件,結果發現,三種不同的單棕櫚酰莽草酸分離效果并不理想,且梯度洗脫比較麻煩。而采用乙腈-水-甲酸 (80∶20∶0.2)體系等強度洗脫時得到了良好的分離效果,能夠將 3-,4-和 5-棕櫚酰莽草酸以及合成原料棕櫚酸和莽草酸全部分開(圖 4),分離效果也優于甲醇-水-甲酸、乙腈-水-乙酸、甲醇-水-乙酸體系。

圖 4 單棕櫚酰莽草酸的高效液相色譜圖Fig.4 analysis of Monopa lmityloxy Shikimic acid with HPLC-ELSD

1.874∶莽草酸(SA)8.267∶4-PSA 8.669∶3-PSA 9.364∶5-PSA 12.796∶棕櫚酸 (PA)

2.3 線性范圍

分別精密吸取 3-,4-和 5-棕櫚酰莽草酸對照品溶液 2、5、10、20、40μL,以峰面積 A(mv.s)的對數值為縱坐標(Y),進樣量 m(μg)的對數值為橫坐標(X),進行線性回歸。分別得到三種單棕櫚酰莽草酸的回歸方程,結果如表 1所示。

表 1 三種單棕櫚酰莽草酸的回歸方程結果Table 1 Results of the regression equations with three kinds of theMonopa lmityloxy Shikimic acid

2.4 精密度實驗

取對照品溶液連續測定 7次進行精密度測定,每次進樣 20μL。用峰面積的相對標準偏差 (RSD)表示,得 3-PSA的 RSD為 1.6%,4-PSA的 RSD為1.8%,5-PSA的 RSD為 1.9%。可見實驗測定重復性很好。

2.5 回收率實驗

取相同已知濃度的樣品溶液 3份,分別加入 3種濃度水平的混合對照溶液,以 3次進樣測定的平均值計算,測得 3-PSA的回收率為 95.2%～98.7%,4-PSA的回收率為 96.1%～98.2%,5-PSA的回收率為 96.3%～98.5%。

2.6 單棕櫚酰莽草酸合成過程中產物濃度的測定

以叔戊醇為反應介質合成單棕櫚酰莽草酸。在合成反應進行中,分別于反應 0,2.5,3.5,4.5,5.5, 6.5,8,9.5,11,12.5,14,16,23,27,32 h取樣進行測定,結果見圖 5。從圖 3可見反應 24 h生成的三種單棕櫚酰莽草酸達到平衡。單棕櫚酰莽草酸的終濃度為:4.6 mmol/L。

圖 5 合成產物中單棕櫚酰莽草酸的濃度隨反應時間的變化Fig.5 Change of the concentration as the change of the time in the synthesis process of Monopalmityloxy Shikimic acid

3 結論

單棕櫚酰莽草酸 (Monopalmityloxy Shikimic Acid,m-PSA)是一類化學新單體 (Chemical New Entity),屬脂溶性莽草酸類衍生物。對于莽草酸的酰化產物研究的報道,僅限于莽草酸的三乙酰化產物和單乙酰化產物,其分析方法主要是高效液相。對于莽草酸與棕櫚酸的單酰化產物的定量分析研究國內外均未見報道。本文采用反相高效液相色譜-蒸發光散射檢測法 (HPLC-ELSD)定量分析了非水相酶促反應合成產物中的三種單棕櫚酰莽草酸。該方法具有簡便、快速、準確、重現性較好的特點。同時為化學新單體單棕櫚酰莽草酸的進一步研究打下了基礎。

1 Frost K.Shikimic acid.Narendra Ambhaikar Group Meeting. 2005.12.1.

2 Ma Y(馬怡),Sun JN(孫建寧),XuQP(徐秋萍),et al.Inhibitory effects of shikimic acid on platelet aggregation and blood coagulation.Acta Phar m Sinica(藥學學報),2000,35 (1):1-3.

3 You YZ(尤永真),Lv GY(呂圭源),Ni ZN(倪竹南).The advance of researches on the pharmacological functions and mechanism of shikimic acid and its derivatives.Chin A rchives Tradit Chin M ed(中華中醫藥學刊),2007,25:386-387.

Quantitative Determ ination of theM onopalm ityloxy Shikim ic Acid by HPLC with ELSD

SUN Yang,TANGLu-hong＊
Department of M olecular&Phar m aceutical B iotechnology of School of M edicine& Phar m aceutics in Jiangnan University,W uxi 214122,China

To establish a method to deter mine the monopalmityloxy shikimic acid quantitatively,high Perfor mance Liquid Chromatographywith EvaporativeLight-ScatterDetectorwas tested and optimized.The deter minationwas carried outon a Symmetry C18(4.6×250 mm i.d.,particle size 5μm)columnwithAcetonitrile-water-for mic acid(80∶20∶0.2)as the mobile phase.The column temperature was 30℃.The flow rate was 0.8 mL/min.The drift tube temperature and nitrogen carrier gas flow rate of ELSD were set at 80℃and 2 L/min,respectively.Monopalmityloxy Shikimic Acid was synthesis using theNovozeme 435.Then prepare through the column chromatography and HPLC.Under such chromatographic conditions,for 3-,4-and 5-pa lmityloxy shikimic aicd,the sample substance,the linear range was 0.21-4.12μg,and good(r=0.9991,0.9998,0.9997),the average recovery was 95.2%-98.7%,96.1%-98.2%,96.3%-98.5%,respectively,and the relative standard deviation was 1.6%,1.8%,1.9%,respectively.This method is simple,rapid,and accurate with good reproducibility and can be used for the quantitative deter mination ofmonopa lmityloxy shik imic acid, particularly suitable for the performance assessing and monitoring of the non-aqueous bio-catalyzed monopalmityloxy shikimic acid synthesis system.

monopa lmityloxy shik imic acid;shikimic acid;quantitative determination;HPLC;ELSD

R284;Q946.91

A

1001-6880(2010)05-0836-04

2009-02-20 接受日期:2009-04-20

＊通訊作者 Tel:86-532-88963253;E-mail:tangluhong@msn.com