金屬絡合法純化銀杏黃酮的研究

張 靜,張曉鳴＊,佟建明,2,夏書芹

1食品科學與技術國家重點實驗室江南大學食品學院無錫 214122;2中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所動物營養學國家重點實驗室北京 100193

金屬絡合法純化銀杏黃酮的研究

張 靜1,張曉鳴1＊,佟建明1,2,夏書芹1

1食品科學與技術國家重點實驗室江南大學食品學院無錫 214122;2中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所動物營養學國家重點實驗室北京 100193

為尋找一種生產周期短、分離效果好、易操作的純化黃酮的方法,本研究利用黃酮與金屬能形成絡合物的性質,從反應體系溶劑、金屬鹽、解絡合劑的添加量優化了絡合法純化銀杏黃酮的工藝。結果表明,pH值對絡合反應的發生及最終產品的性質具有很重要的影響。金屬絡合純化法的最佳工藝條件為:以 100 mL甲醇為溶劑,黃酮濃度為 2.4 mg/mL,0.20 g硫酸鋅為絡合劑,反應溶液pH值為 9.50,0.2 g EDTA為解絡合劑,可以使銀杏提取物中黃酮含量由 24%提高到 55%,得率為 58%。

銀杏黃酮;金屬;pH值;絡合;純化

黃酮類化合物是植物界廣泛存在的多酚類化合物,是天然的抗氧化劑[1,2]。目前國外對黃酮的分離純化主要使用柱層析法[3,4],該方法需要大量的人力,時間和溶劑,因此尋找更快速有效的分離方法將會為黃酮類化合物更廣泛的應用提供有利的幫助。

提取分離出具有較高生物活性的化合物對醫藥及食品工業是非常重要的工作,黃酮的純化是研究具有生物活性的黃酮類化合物的重要課題之一。目前銀杏黃酮類化合物的純化分離技術存在很大的發展空間。通過研究人們發現黃酮類化合物抗氧化作用的機制之一是能與體系中的促氧劑金屬離子絡合,從而達到抗氧化的效果[5]。近年來,黃酮類化合物與金屬的絡合物日益受到廣泛的關注,隨著對黃酮與金屬絡合物的合成、表征、及理化性質的研究,黃酮與金屬絡合物也越來越被認識和應用,如槲皮素鈷,槲皮素銅,槲皮素鋁等[6-10]。研究資料表明絡合態的黃酮比游離態的黃酮具有更強的生理活性[11]。

研究顯示黃酮與金屬形成絡合物后即形成沉淀,收集沉淀則可得到黃酮與金屬的絡合物[10,11]。銀杏葉提取物中含有很多與金屬不能形成絡合物的雜質,因此可以利用黃酮與金屬絡合的性質使其與雜質進行分離。設想如果能找到一種更強的金屬絡合劑與黃酮金屬絡合物反應,則黃酮從絡合態又轉變為游離態,將游離出來的黃酮與金屬分離,則實現了黃酮的純化;如果不進行解離,則合成的黃酮-金屬絡合物本身可作為具備強生理活性的物質。在純化過程中可能會導致金屬的殘留,這些殘留的金屬將會以絡合態存在,據報道食入黃酮與痕量的金屬如鋅等的反應物可以提高人類小腸細胞對黃酮的代謝水平[12]。因此,用黃酮與金屬的絡合-解離法純化銀杏黃酮是完全可行的。

曾有報道關于鉛鹽沉淀法進行黃酮類化合物純化分離的研究[13],但鉛鹽沉淀法只適于具有鄰二羥基的黃酮類化合物,并且金屬鉛毒性較強,因此該分離方法具有很大的局限性。

本文選用具有絡合能力的過渡態金屬銅鹽和鋅鹽,研究其對銀杏黃酮的絡合反應及解絡合反應的條件,以期探索出新的快速高效的制備高純銀杏黃酮的方法,并且,所制備的銀杏黃酮與金屬的絡合物也可以作為功能因子直接加以利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏葉提取物(GBE,由山東永春堂藥業有限公司提供);硫酸鋅、硫酸銅、乙酸鋅、乙酸銅、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸(EDTA),蘆丁,購于美國 Sigma公司;甲醇、乙醇分均為分析純,購于國藥集團化學試劑有限公司;XT5502往復式振蕩恒溫液浴槽 (杭州雪中炭恒溫技術有限公司);UV-1600分光光度計(上海美譜達儀器有限公司);WSC-S測色色差計(上海精密儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 純化工藝

將 100 mL一定濃度的銀杏葉提取物 (GBE)溶液(甲醇,乙醇)中,分別加入一定量的硫酸鋅,乙酸鋅,硫酸銅,乙酸銅,攪拌溶液至反應完全后,邊攪拌邊用NaOH溶液調溶液 pH值至溶液中黃酮濃度基本不變。離心,收集沉淀。將收集好的反應物沉淀分散于 30%的乙醇水溶液中,分別加入不同量的EDTA,于 60℃水浴中振蕩反應至沉淀完全溶解,反應完全后,減壓濃縮至干,分別用 50 mL甲醇溶解過濾,將濾液濃縮,干燥后稱重,檢測所得樣品中黃酮含量。

1.2.2 總黃酮含量的測定

總黃酮的含量測定采用比色法[14]。精確吸取標準蘆丁對照品溶液 (0.2 mg/mL)0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,分別置于 10 mL容量瓶中,各加60%乙醇液至 5 mL,加 5%NaNO2溶液 0.3 mL,搖勻放置 6 min,再加 10%AL(NO3)3溶液 0.3 mL,搖勻,再放置6 min,加4%NaOH溶液4 mL,搖勻放置10～20 min,定容。在 510 nm處,以第一管溶液作空白分別測定吸光度,以吸光度對濃度進行回歸,繪制標準曲線。將蘆丁換成樣品,同樣方法測定吸光度,查閱標準曲線,計算黃酮含量。

1.2.3 樣品中金屬鋅含量的測定。采用原子吸收法測定,GB/T 5009.14-1996。

1.2.4 樣品色澤采用色差計檢測。

1.3 數據分析

使用 SPSS軟件,采用 t檢驗對數據進行方差分析。

2 結果與討論

2.1 不同溶劑對絡合反應的影響

實驗分別考察了甲醇、乙醇兩種溶劑體系對絡合反應的影響。結果如表 1所示。

表 1 不同溶劑對絡合反應的影響(±sD)Table 1 The influence of the solvent on the chelating reaction(±sD)

表 1 不同溶劑對絡合反應的影響(±sD)Table 1 The influence of the solvent on the chelating reaction(±sD)

溶劑Solvent黃酮濃度 The flavonoid concentration (mg/mL)硫酸銅濃度The CuSO4concentration (mg/mL)溶液中剩余黃酮濃度The concentration of the solution after complexation(mg/mL)反應率The flavonoid complexation ratio (%)無水乙醇(Ethanol) 2.40 5.00 1.53±0.15 36.25±0.40無水乙醇(Ethanol) 1.20 5.00 0.62±0.09 48.33±0.29無水甲醇(Methanol) 2.40 5.00 0.56±0.21 76.67±0.36無水甲醇(Methanol) 1.20 5.00 0.31±0.17 74.17±0.21

表 1結果表明甲醇作溶劑更利于黃酮與金屬絡合反應的進行。在無水乙醇體系中,黃酮濃度的差異對絡合反應有一定的影響,但相比甲醇體系來看,反應率仍然比較低。因此,在接下來的實驗中選擇甲醇作為反應溶劑。

2.2 不同 pH值對金屬離子絡合反應的影響

實驗分別用硫酸銅,乙酸銅,硫酸鋅,乙酸鋅四種金屬鹽作為絡合劑,考察在不同 pH值時的絡合反應,結果如圖 1所示。

圖 1 pH值對金屬絡合反應的影響Fig.1 The influence of the pH on the complexation reaction

結果表明,結果表明,當加入金屬鹽后,溶液 pH值隨著絡合物的生成 pH略有下降 (銀杏黃酮的甲醇液 pH約為 6.2左右),并且加入不同的金屬鹽時,黃酮反應生成絡合物的程度不同。其中,硫酸鋅絡合物生成率最低,其它三種比較接近。當用NaOH溶液調節溶液 pH值時,隨著 pH值的升高,黃酮繼續與金屬反應生成絡合物。當 pH值在 7.5左右時,加入乙酸銅,硫酸銅,乙酸鋅鹽的溶液中黃酮絡合反應率先后達到最大,而硫酸鋅溶液中在 pH 9.5時才達到最大。隨著溶液 pH值的繼續增大,溶液中黃酮絡合物的反應率有少許下降后基本保持平穩狀態。Wendell等指出溶液 pH值是影響黃酮金屬絡合物形成的眾多重要因素的一個[15]。有資料顯示[7],黃酮在堿性環境中更有利于和金屬形成絡合物,這可能是因為堿性條件下黃酮酚羥基的氫離子容易質子化,導致黃酮易于金屬發生反應。相比于鋅鹽,銅鹽的絡合能力更強,因此能在較低的 pH值時達到反應平衡。當溶液達到平衡時,繼續增大溶液 pH值,黃酮的反應率稍微有些下降,這可能是因為在 pH較高時,金屬離子參與了其它副反應,如水解反應等;并且,較高的 pH值能導致黃酮絡合物的分解[16]?？紤]到絡合及分離的需要,選取的金屬絡合劑要在甲醇溶劑中不能有太強的絡合能力,但經過條件調控又能提高黃酮絡合物沉淀的產率,因此我們選擇硫酸鋅作為金屬絡合劑。

2.3 不同 EDTA的量對解絡合反應的影響

本研究以硫酸鋅反應后的沉淀為樣品,考察了不同 EDTA的加入量對最終樣品的影響入圖 2所示。

由結果可以看出,EDTA的加入量為 0.2 g時,樣品中黃酮含量最高約 55%左右。EDTA的加入量對黃酮的得率影響并不大 (P＜0.05),但在大于 0.2后,黃酮的得率和黃酮含量均有下降的趨勢,因此添加量 0.2是最優添加量。EDTA是很強的金屬絡合劑,且它的絡合能力比黃酮的金屬絡合能力強的多[17],因此,在黃酮金屬絡合物的乙醇液中,EDTA能夠優先與金屬絡合,而使黃酮從絡合態變為游離態。根據 EDTA與金屬的絡合物不溶于甲醇液,而黃酮在甲醇中具有良好的溶解性從而將游離態的黃酮與 EDTA金屬絡合物分開,從而得到黃酮含量更高的銀杏提取物。

圖2 EDTA量對終產品的影響Fig.2 Influence of EDTA on the purification effect

2.4 不同金屬鹽對終樣品的黃酮含量及黃酮得率的影響

實驗研究了四種常見金屬鹽對最終純化后樣品的黃酮含量,得率的影響,結果如表 2所示。由結果可以看出,四種金屬都對黃酮起到了純化作用,相對于銅鹽,鋅鹽絡合純化后樣品中黃酮含量更高。硫酸鋅絡合純化后樣品黃酮含量,黃酮得率分別可達55%和 58%左右,因此硫酸鋅是最好的絡合劑。從圖 1也可以看出,在低 pH值時硫酸鋅的絡合反應程度最低,因此在后面用甲醇分離 EDTA-金屬的絡合物與游離態的黃酮時,黃酮與金屬的再次絡合的反應程度最小,而對于在較低 pH值時就具有強絡合能力的金屬鹽,則再次形成絡合物的可能性比較大,因此最終分離后產品的黃酮含量和黃酮得率都比較低。

2.5 分離后產品的品質評價

在相同的黃酮濃度時,絡合純化過程對硫酸鋅絡合純化后產品抗氧化活性基本沒有影響[18],本實驗從純化后樣品的外觀、金屬殘留量兩方面對其進行評價,其結果如表 3所示。

由表 3可以看出,純化前后樣品的色澤沒有顯著性差異(P＜0.05),但純化后樣品中鋅含量很高,達到 9.0 mg/g。鋅元素是人體不可缺少的元素,但過量使用也會引起中毒,FAO/WHO暫定的每人每日允許攝入量為 60 mg,相當于每天攝入提取物 6 g,而實際上銀杏黃酮作為食品藥品添加劑,其使用量遠小于 6 g/d,因此,產品中的鋅含量不會達到致毒量,并且能彌補植物源食品中鋅含量低的不足,并且因為黃酮的金屬絡合物比游離態的黃酮具有更強的生物活性[13],適量的鋅的含量有利于提高銀杏提取物的生物利用率。

表 2 金屬鹽對純化效果的影響Table 2 The influence of the metal on the purification effect

表 3 硫酸鋅絡合純化前后樣品的比較Table 3 The property of the product before and after purification by zinc sulfate complexmethod

3 結論

相對于乙醇,甲醇體系是更好的形成黃酮絡合物的體系。pH值對銀杏黃酮與金屬的絡合反應具有很大的影響,堿性環境利于絡合物的生成。pH值9.5是硫酸鋅與銀杏黃酮形成絡合物的適宜 pH值。每 100 mL黃酮濃度為 2.3 mg/mL的銀杏提取物溶液與 0.2 g硫酸鋅反應,在溶液 pH 9.5時生成的絡合物,用 0.2 g的 EDTA作為解絡合劑可以得到黃酮含量為 55%(以蘆丁計)以上的純化樣品,得率為58%。

金屬絡合-解離法純化黃酮工藝簡單,操作周期短,原料廉價易得,溶劑回收簡單,耗能低,容易實現工業化。這種方法將改善現存的純化方法中存在的大量使用溶劑,操作時間長,純化成本高的問題,是一種有發展前景的黃酮純化方法。

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Purification of Ginkgo Flavonoid byM etal ComplexM ethod

ZHANG Jing1,ZHANG Xiao-ming1＊,TONG Jian-ming1,2,XIA Shu-qin1

1State Key Laboratory of Food Science and Technology,School of Food Science and Technology,Jiangnan University,W uxi 214122;2State Key Laboratory of Anim al Nutrion,Institute of Anim al Sciences,Chinese Academ y of Agricultural Sciences,Beijing 100193

To develop a flavonoid-complexmethod for purification of flavonoid,the purification conditions for ginkgo flavonoid were studiedwhich included the solvent,themetal,the pH value for complex formation,and the EDTA for decomposition the complex.The results indicated that the pH valuewas themost important factor to the purification process and the optimized conditions to purify ginkgo flavonoids were as follow:100 mL methanol as solvent,the ginkgo flavonoid concentration was 2.4 mg/ml,0.20 g zinc sulfate as chelating agent,pH value at 9.50,and EDTA(0.20 g)as reagent to decompose complex.After one turn,the flavonoid content was increased from 24% to 55%and the recovery was 58%.

gingko flavonoid;metal;pH value;complex;purification

TS202.3

A

1001-6880(2010)05-0751-05

2010-06-25 接受日期:2010-07-27

國家“十一五”科技支撐項目(2006BAD12B05)

＊通訊作者 Tel:86-532-88963253;E-mail:xmzhang@jiangnan.edu.cn