減毒活菌卡介苗對哮喘TLR4表達的影響

張雅琴 眭建

哮喘存在有氣道高反應性、Ig-E調節和特異性反應基因。Toll樣受體是在哺乳動物中發現的與果蠅有同源性的蛋白，命名為TLR，最初發現的TLR4是目前研究最多的［1］。研究證實，BCG其分枝桿菌脂蛋白能與巨噬細胞上Toll樣受體結合，促進巨噬細胞產生IL-12、IFN-γ，抑制IL-4、IL-5的產生，從而糾正哮喘中Th1/Th2亞群數目和(或)功能失衡［2］。本實驗意在研究BCG對哮喘小鼠模型中肺組織TLR4的影響，為臨床哮喘治療提供新的研究方向及思路，并將發現以TLRs和其信號途徑作為靶點去治療、干預多種疾病的新方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 昆明種小白鼠、卵白蛋白(OVA，GradeⅡ)、減毒活菌卡介苗(BCG)、抗TLR4單克隆抗體、抗GAPDH單克隆抗體、HRP標記的小鼠IgG抗體等。

1.2 實驗動物的分組及致敏模型制備 實驗動物隨機分為三組，分別為空白對照組、哮喘發病組和BCG干預組，每組10只小鼠。哮喘發病組：第1、7、14天腹腔注射0.08%OVA致敏，每次0.2 ml，Al(OH)3作為免疫佐劑。第15天開始霧化激發;BCG干預組：哮喘模型的建立同哮喘發病組，在每次致敏前1 d和最后霧化激發1 h內BCG皮內注射再次干預，每次劑量為0.025 mg;空白對照組：用生理鹽水代替OVA。所有小鼠在最后一次激發24 h后獲取標本。

1.3 小鼠肺組織TLR4蛋白的Western Blotting檢測 取各組實驗小鼠肺組織提取總蛋白，測定濃度。各組蛋白樣品SDS-PAGE電泳后，電轉移至PVDF膜上。PVDF膜經封閉2 h后，用稀釋后的TLR4單克隆抗體，4℃孵育過夜。再進一步與辣根過氧化物酶偶聯的二抗孵育后，滴加化學發光底物，X-光膠片感光檢測蛋白信號。

1.4 統計學方法 所有實驗結果采用SPSS10.0軟件進行統計分析，計量數據以()的形式表示。組間差異采用t檢驗。

圖1 各組小鼠肺組織中TLR4蛋白表達的Western Blotting鑒定

2 結果

TLR4蛋白在空白對照組的肺組織中僅有微量的表達，哮喘發病組中TLR4蛋白的表達量較對照組略有升高，而BCG干預組中TLR4蛋白的表達量較前兩組均有顯著的增強(灰度分析數據未顯示)。

3 討論

BCG為結核桿菌的減毒活疫苗，其主要成分是卡介苗核糖核酸。研究證實［3］，TLR4的配體結合TLR4后，通過跨膜結構將病原相關分子刺激信號轉導入細胞內，產生復雜的級聯信號反應，其中TLR4-NF-KB信號途徑參與細胞免疫應答、炎性反應和抗凋亡相關基因的轉錄是細胞免疫學領域的研究熱點。但BCG是否也能通過TLR4途徑介導并激活Th1型免疫反應尚不清楚。

我們通過實驗發現經BCG干預后，TLR4基因表達量與空白對照組以及哮喘發病組相比均有顯著升高。BCG可能是通過刺激TLR4表達上調，進而調節Th1/Th2平衡，在哮喘發病的治療中發揮重要作用。而關于BCG作為TLR4的配體如何發揮功能仍需進一步的實驗研究驗證。

［1］Mikko Hallman，Mika R met，et al.Toll-Like Receptors As Sensors Of Pathogens.Pediatric Research，2001，50(3).

［2］I.S.Choi，Y.I.Koh.Effects of BCG revaccination on asthma.Allergy，2003，58：1114-1116.

［3］An De Creus，Masanori Abe，et al.Low TLR4 Expression by Liver Dendritic Cells Correlates with Reduced Capacity to Activate Allogeneic T Cells in Response to Endotoxin1.The Journal of Immunology，2005，174：2037-2045.