舒筋通絡外用顆粒質量標準的研究

夏 曦，劉 玲

（廣東省佛山市順德龍江醫院，廣東順德 528318）

舒筋通絡外用顆粒為順德龍江醫院制劑，由當歸、大黃、獨活、桂枝等十三味中藥組成。采用部分藥材粉碎成細粉，其余藥材水煮醇沉制成稠浸膏后與細粉混合干燥而成的一種外用顆粒劑。使用時加水外洗、外敷均可，具有溫經通絡，祛瘀止痛的作用，用于跌打損傷，筋骨疼痛，關節不利。本文建立了當歸、大黃、獨活、桂枝的薄層色譜鑒別，并采用高效液相色譜法對其主要成分大黃素（C15H10O5）和大黃酚（C15H10O4）進行含量測定，現報道如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀、Agilent化學工作站（美國安捷倫科技有限公司）；METTLER AE240電子分析天平；CQ-20超聲波清洗器。

1.2 試藥

大黃素、大黃酚對照品及當歸、獨活、桂枝、大黃對照藥材，均由中國藥品生物制品檢定所提供；舒筋通絡外用顆粒，由廣東省順德龍江醫院制劑室提供；甲醇光譜純（天津四友化工廠）；薄層層析硅膠G（化學純，中國青島海洋化工集團公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 當歸、桂枝、獨活薄層鑒別

因大黃的5個蒽醌類成分對當歸、桂枝、獨活的薄層色譜鑒別有干擾，故先用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液將其分離出去；曾用石油醚（60～90℃）-醋酸乙酯（4∶1）為展開劑進行薄層層析，但當歸的色譜斑點與桂枝的色譜斑點分離度欠佳，當選用大黃的薄層色譜展開劑系統時，當歸、桂枝、獨活的色譜成分均能達到有效分離。

2.1.1.1 供試品溶液的制備 取本品3 g，研細，加乙醚40 ml，超聲處理10 min，濾過，濾液置分液漏斗中，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液洗滌3次，每次20 ml，合并洗液，備用。乙醚液再用水10 ml，洗滌1次，揮干乙醚，殘渣加無水乙醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。

2.1.1.2 對照藥材溶液的制備 取當歸對照藥材0.8 g，桂枝對照藥材0.2 g，獨活對照藥材0.5 g，分別加乙醚30 ml，超聲處理10 min，濾過，濾液揮干，殘渣加無水乙醇1 ml使溶解，作為對照藥材溶液。

2.1.1.3 陰性對照溶液的制備 按處方比例及制法，分別制成缺當歸、桂枝、獨活的陰性樣品，各取3 g，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.1.1.4 薄層層析 照薄層色譜法（《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述七種溶液各2 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60℃）－甲酸乙酯－甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢識。供試品色譜中，在與當歸對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的亮藍白色熒光斑點；在與桂枝對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的綠色熒光斑點；在與獨活對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的藍紫色熒光斑點。陰性對照色譜在相應位置上無干擾，可作為當歸、桂枝、獨活的薄層色譜鑒別，結果見圖1。

2.1.2 大黃薄層鑒別

大黃中含有多種蒽醌類成分，具有抗菌、抗感染等作用。考慮大黃素和大黃酚在其他藥材中存在，故在含量測定項測定大黃素和大黃酚之前，還要進行大黃的薄層色譜鑒別，用大黃對照藥材作為對照，與其他含有大黃素和大黃酚的藥材進行區別。

2.1.2.1 供試品溶液的制備 取“2.1.1.1”項下的洗液用1 mol/L鹽酸溶液調節pH值至1～2，用乙醚提取3次，每次20 ml，合并提取液，揮干，殘渣加無水乙醇5 ml使溶解，作為供試品溶液。

2.1.2.2 大黃對照藥材溶液的制備 取大黃對照藥材0.1 g，加乙醚30 ml，超聲處理10 min，濾過，濾液揮干，殘渣加無水乙醇1 ml使溶解，作為對照藥材溶液。

2.1.2.3 大黃陰性對照溶液的制備 按處方比例及制法，制成不含大黃的陰性樣品，取3 g，按“2.1.2.1”項下方法制成大黃陰性對照溶液。

2.1.2.4 薄層層析 照薄層色譜法（《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述三種溶液各5 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60℃）－甲酸乙酯－甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢識。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的5個橙黃色熒光主斑點。陰性對照色譜在相應位置上無干擾，可作為大黃的薄層色譜鑒別，結果見圖2。

因當歸、桂枝、獨活的色譜成分對大黃的薄層色譜鑒別有干擾，故先將大黃的蒽醌類成分用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液分離出來，酸化后再用乙醚進行提取。

2.2 含量測定

本品處方由13味中藥組成，其中以大黃為主藥，大黃素和大黃酚是其主要有效成分，故選作含量測定指標。正文參照《中國藥典》2005年版及2000年版一部“大黃”項下收載的含量測定方法，采用HPLC法測定兩者的總量，試驗結果如下：

2.2.1 色譜條件

色譜柱：大連依利特Hypersil ODS-2（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）；檢測波長：254 nm；流速：1.0 ml/min。 柱溫：30℃。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取大黃素和大黃酚對照品適量，加甲醇制成每毫升含大黃素10 μg、大黃酚25 μg的混合溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備

取本品，研細，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續濾液5 ml，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10 ml，超聲處理2 min，再加三氯甲烷10 ml，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并置入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 ml，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，轉移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 陰性溶液的制備

取按處方比例及制法制備的缺大黃陰性樣品，按“2.2.3”項下方法制備樣品溶液，即得。

2.2.5 測定波長的選擇

分別取大黃素和大黃酚對照品溶液，在200～500 nm波長范圍內掃描，結果大黃素在 221、254、265、290、437 nm，大黃酚在 204、225、256、278、287、429 nm 波長處有最大吸收，兩者均在（254±2）nm波長處有最大吸收，為了同時測定大黃素和大黃酚的含量，故選擇測定波長為254 nm，與《中國藥典》2000年版及2005年版一部“大黃”含量測定項下測定波長相同。

2.2.6 系統適用性

分別取對照品溶液、供試品溶液以及陰性對照品溶液，按上述色譜條件進行試驗，考察系統適用性。HPLC色譜圖見圖3。結果表明陰性對照品溶液對測定沒有干擾。

2.2.7 線性關系考察

2.2.7.1 大黃素 分別精密吸取每毫升含大黃素1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg 的大黃素對照品溶液 10 μl，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定色譜峰面積，測得峰面積分別為 37.25、73.35、185.51、372.17、744.59、1 868.63。 以對照品進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標，計算回歸方程，結果表明，大黃素在0.010 0～0.500 0 μg范圍內，呈良好的線性關系。回歸方程為Y=3 738.66X-1.420 8（r=0.999 9）。

2.2.7.2 大黃酚 分別精密吸取每毫升含大黃酚2.50、5.00、12.50、25.00、50.00、125.00 μg 的大黃酚對照品溶液 10 μl，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定色譜峰面積，測得峰面積分別為 129.37、259.09、649.07、1 325.46、2 636.84、6 388.43。以對照品進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標，計算回歸方程，結果表明，大黃素在0.025 0～1.250 0 μg范圍內，呈良好的線性關系。回歸方程為Y=511 1.80X-23.717 7（r=0.999 9）。

2.2.8 精密度試驗

精密吸取大黃素（10.00 μg/ml）、大黃酚（25.00 μg/ml）混合對照品溶液10 μl，重復進樣6次，按上述色譜條件測定色譜峰面積，結果表明本法精密度良好。見表1。

表1 精密度試驗（n=6）Tab.1 Precision test(n=6)

2.2.9 重復性試驗

取同一批樣品（批號：050701），按“2.2.3”項下方法制備6份供試品溶液，分別測定色譜峰面積，結果表明本法重復性良好。見表2。

表2 重復性試驗（n=6）Tab.2 Repeatability test(n=6)

2.2.10 穩定性試驗

取“2.2.3”項下供試品溶液，分別于放置 0、1、2、3、4、24 h后，注入液相色譜儀，測定色譜峰面積，結果表明供試品溶液在24 h內基本穩定。見表3。

表3 穩定性試驗（n=6）Tab.3 Stability test(n=6)

2.2.11 加樣回收試驗

取同一供試品（批號：050701，測得大黃素含量為0.6654mg/g、大黃酚為1.640 3 mg/g）6份，各0.5 g，精密稱定，分別精密加入對照品溶液（含大黃素 50.00 μg/ml、大黃酚 125.00 μg/ml）各5 ml，混勻，水浴揮干，按含量測定方法進行測定并計算回收率。結果見表4、5。

2.2.12 樣品含量測定

取3批樣品，按“2.2.3”項下方法制備樣品溶液，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，取續濾液，按上述色譜條件測定色譜峰面積，用外標法計算樣品中大黃素和大黃酚的含量，結果見表6。

3 討論

本品為外用顆粒劑，使用時只要加溫水溶化即可。經文獻檢索未發現類似的制劑，為本院制劑室獨有，具有劑量小，攜帶方便等諸多優點。在本院臨床以來，具有療效確切、起效快、療程短、未見毒副反應發生，據不完全統計總有效率為95%以上，這為中藥外用制劑的開發提供了一個新的途徑。

表4 大黃素加樣回收試驗（n=6）Tab.4 Recovery test of Emodin(n=6)

表5 大黃酚加樣回收試驗（n=6）Tab.5 Recovery test of Chrysophanol(n=6)

表6 樣品含量測定結果（%，n=3）Tab.6 Content determination results of samples(%,n=3)

由于處方中成分較復雜，干擾了薄層色譜的檢識，作者充分利用處方中欲測成分不同化學性質，采用各種前處理方法，有效地排除了干擾，保留了欲測成分，對處方中主要組成藥物當歸、桂枝、獨活、大黃進行了薄層分析，薄層色譜顯示清晰，空白無干擾。

本實驗采用高效液相色譜法測定樣品中大黃素和大黃酚的含量，重現性好，精密度高，易于操作，能夠有效地控制產品質量。成品要求含大黃素不得低于8 mg/15 g和大黃酚不得低于20 mg/15 g。本法可作為測定中藥復方制劑中大黃素和大黃酚含量的參考。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].一部.北京:化學工業出版社,2005:17.

[2]陰健.中藥現代研究與臨床應用[M].北京:中醫古藉出版社,1994:66.

[3]黎俊華.復方止血顆粒的質量標準研究[J].中國藥房,2006,17(8):614.

[4]郭丹,陳娜娜.高效液相色譜法測定常通口服液中大黃素的含量[J].中國藥房,2003,14(5):206.

[5]廖華衛,李瑞珍.大黃中大黃酚的提取分離和純化方法研究[J].中國藥房,2006,17(12):956.

[6]張曉東.高效液相色譜法測定舒筋片中大黃素、大黃酚的含量[J].中國醫藥導報,2007,4(18):78-80.

[7]張斯時.大黃素藥理作用的研究概況[J].中國醫藥導報,2006,3(23):68-69.

[8]蔣云根,白玫.高效液相色譜法測定喜食片中大黃素、大黃酚的含量[J].第四軍醫大學學報,2009,30(15):109-110.