復元膠囊對大鼠實驗性骨關節炎軟骨IL-6、bFGF的干預研究

梁曉芳，李榮亨，唐 靜（重慶醫科大學附屬第一醫院中西醫結合科，重慶市 400016）

復元膠囊對大鼠實驗性骨關節炎軟骨IL-6、bFGF的干預研究

梁曉芳＊，李榮亨#，唐 靜（重慶醫科大學附屬第一醫院中西醫結合科，重慶市 400016）

目的：研究復元膠囊對大鼠實驗性骨關節炎（OA）軟骨白細胞介素-6（IL-6）和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）表達的影響。方法：Hulth法復制大鼠OA模型，隨機分為對照、模型、四環素和復元膠囊高、中、低劑量組。灌胃給藥，每天1次，連續10周。10周后取軟骨標本，行大體觀察、Mankin’s評分及免疫組化測定軟骨中IL-6、bFGF的表達水平，并將IL-6、bFGF的表達水平與Mankin’s評分指數進行Pearson相關分析。結果：復元膠囊各組關節軟骨Mankin’s評分、IL-6表達水平均低于模型組（P＜0.01或P＜0.05），bFGF表達水平均高于模型組（P＜0.01）；復元膠囊各劑量組Mankin’s評分差異具有顯著性（P＜0.05），IL-6表達水平與關節病理改變的Mankin’s評分指數呈正相關（P＜0.01），bFGF表達水平與關節病理改變的Mankin’s評分無明顯相關。結論：復元膠囊能下調大鼠OA軟骨IL-6的表達，上調bFGF的表達，其作用呈劑量依賴性。高劑量復元膠囊抗大鼠OA作用與四環素相當。

骨關節炎；復元膠囊；白細胞介素-6；堿性成纖維細胞生長因子

骨關節炎（Osteoarthritis，OA）是中老年人最常見的關節疾病。OA的產生，是一系列生物化學及生物力學因素共同作用的結果，最終導致軟骨基質的降解。軟骨基質降解和修復失衡的始發路徑由細胞因子及化學增活素介導。在體及體外實驗研究均表明，阻斷這些細胞因子及化學增活素可消除其效應。在OA患者軟骨組織及關節滑液中，白細胞介素-6（IL-6）含量明顯升高，并呈隨病情加劇而升高的趨勢[1]。堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）是目前已知最強的促細胞生長因子，可刺激成軟骨細胞增殖和分化，并具有反分化作用，能抑制軟骨鈣化。研究表明，bFGF參與膠原及軟骨細胞的再生[2]，在OA的軟骨及基質修復中發揮重要作用。本文主要研究復元膠囊（Fyc）對大鼠實驗性OA軟骨IL-6、bFGF的影響，探討其抗OA的作用機制。

1 材料

1.1 儀器

HWS-40B型恒溫水浴箱（江蘇太倉實驗設備廠）；MDF 328型低溫冰箱（日本三洋公司）；BX-50型生物顯微鏡（日本Olympus公司）；HPS-3C型pH計（上海雷磁儀器廠）。

1.2 試藥

Fyc（重慶希爾安藥業公司，批號：20090203，規格：每粒0.41 g）；四環素（太極集團西南藥業股份有限公司，批號：20090412，規格：每片250 mg）；大鼠IL-6及bFGF免疫組化試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）；青霉素（華北制藥股份有限公司，批號：D0809103）。

1.3 動物

SD清潔級大鼠60只，♂，體質量（300±10）g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供（動物合格證號：SCXY（渝）20020003）。

2 方法

2.1 模型復制及分組、給藥

隨機選10只SD大鼠為對照組，行皮膚切開后縫合；剩余50只以Hulth法[3]復制模型。術后予iv青霉素8×104IU·kg-1，每天1次，連續7 d。術后1周將模型大鼠隨機分為模型、四環素（50 mg·kg-1）和Fyc高、中、低劑量（2 229.9、743.3、371.65 mg·kg-1）組，ig 給藥，每天1次，且每天驅趕大鼠跑步30 min，連續10周。

2.2 觀察指標

2.2.1 大體觀察關節軟骨 軟骨標本按以下原則評分：關節面光整，色澤正常（0分）；關節面粗糙，有裂隙，色澤灰暗（1分）；關節面糜爛，軟骨缺損達軟骨表中層（2分）；關節面潰瘍形成，軟骨缺損達軟骨深層（3分）；軟骨剝脫，軟骨下骨暴露（4分）。

2.2.2 光鏡觀察關節軟骨 取股骨內髁及脛骨平臺軟骨標本，4%多聚甲醛固定，10%EDTA脫鈣2周，常規石蠟包埋，切片，HE染色，依據Mankin’s標準評分。

2.2.3 免疫組化檢測IL-6、bFGF蛋白表達 IL-6、bFGF表達按免疫組化試劑盒說明書操作。圖像分析：每個標本取4張切片，每張切片隨機取5個視野，用北航醫學圖像分析管理系統測定陽性細胞的百分數。

2.3 統計學方法

3 結果

3.1 大體觀察結果

對照組軟骨面光滑，呈淡藍色。模型及各用藥組軟骨面粗燥，呈淡黃色毛刺狀，以模型組最突出，關節腔積液，滑膜顯著增生，軟骨面可見裂紋、糜爛及潰瘍形成，部分潰瘍深達軟骨下骨。Fyc各劑量組及四環素組損傷較模型組輕。各組關節軟骨大體評分結果見表1。

3.2 光鏡觀察結果及Mankin’s評分

對照組關節軟骨結構正常，細胞排列整齊，潮線完整。模型組軟骨染色不均，裂隙多，部分深達鈣化帶，細胞數目減少，排列紊亂，見多重潮線。四環素及Fyc各劑量組Mankin’s評分較模型組低。Mankin’s評分結果見表1。

表1 各組關節軟骨大體及Mankin’s評分（±s）Tab 1 Macroscopic grading score and Mankin’s score in each grou（p±s）

表1 各組關節軟骨大體及Mankin’s評分（±s）Tab 1 Macroscopic grading score and Mankin’s score in each grou（p±s）

與對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

Mankin’s評分0.2±0.421 8.4±0.966＊4.2±0.918##3.4±0.966##5.9±0.994#7.4±1.173#n組別對照組模型組四環素組Fyc高劑量組Fyc中劑量組Fyc低劑量組10 10 10 10 10 10大體評分0 3.4±0.699＊1.9±0.567##1.7±0.674##2.6±0.699#2.9±0.737

3.3 軟骨組織中IL-6和bFGF的表達

3.3.1 IL-6的表達 模型組全層軟骨中IL-6表達較對照組顯著升高（P＜0.01），各用藥組IL-6表達顯著低于模型組（P＜0.01）；Fyc高劑量組與四環素組IL-6表達無顯著性差異（P＞0.05）。各組關節軟骨IL-6表達水平比較見表2。

3.3.2 bFGF的表達 對照組軟骨bFGF均勻分布，模型組軟骨bFGF表達較對照組高（P＜0.01），各給藥組bFGF表達顯著高于模型組（P＜0.01）；Fyc高劑量組bFGF表達高于四環素組（P＜0.05）。各組關節軟骨bFGF表達水平比較見表2。

表2 各組關節軟骨IL-6、bFGF表達水平比較（±s）Tab 2 Expression of IL-6 and bFGF in each group（±s）

表2 各組關節軟骨IL-6、bFGF表達水平比較（±s）Tab 2 Expression of IL-6 and bFGF in each group（±s）

與對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.01

n組別對照組模型組四環素組Fyc高劑量組Fyc中劑量組Fyc低劑量組10 10 10 10 10 10 IL-6表達0.193±0.015 0.336±0.028＊0.250±0.016#0.259±0.014#0.288±0.024#0.299±0.015#bFGF表達0.558±0.018 0.595±0.024＊0.685±0.027#0.738±0.022#0.679±0.024#0.632±0.019#

3.3.3 Pearson相關分析 （1）IL-6與Mankin’s評分：兩者相關系數r＝0.963 8，P＜0.01，呈顯著正相關；（2）bFGF 與Mankin’s評分：兩者相關系數r＝0.154，P＞0.05，無顯著相關。IL-6、bFGF表達率與Mankin's評分的相關性見圖1。

4 討論

OA屬于中醫“痹證”、“骨痹”范疇，其病因病機概括起來，一為因虛致病：肝腎精虛，無以主骨養筋，筋骨失養，風寒濕邪入侵而為痹；二為因病致虛：跌仆閃挫，筋骨勞損，致氣虛血瘀，久則肝腎虧損，氣血不調，脈絡失和而為痹。本病為本虛標實之證，Fyc配伍淫羊霍、鹿角膠、黃芪、川芎、丹參、三七粉等中藥，以補腎益氣、活血化瘀為法，標本兼治，為臨床治療OA的有效復方。前期研究表明，Fyc可減輕軟骨病變，對軟骨退變有防治作用。

現代醫學認為，OA是多因素共同作用下，軟骨細胞、細胞外基質及軟骨下骨三者間分解和合成代謝失衡的結果。關節軟骨退化及破壞是OA的主要病理特征。許多細胞因子及蛋白酶參與了關節軟骨降解的發生發展。IL-6是一種多效細胞因子，研究發現，IL-6誘導關節軟骨的降解，在骨重建過程中調控骨吸收及生成之間的平衡、誘導MMP-13表達，促進軟骨基質中二型膠原的降解[3]。在骨關節炎軟骨中IL-6表達顯著增加；對體外培養的兔軟骨細胞，IL-6可抑制bFGF誘導的細胞集落形成，抑制軟骨基質蛋白多糖的合成，并顯著增強IL-1β誘導的蛋白多糖降解[4]，提示IL-6是一個軟骨細胞增生及關節軟骨代謝的負向調節劑。

此外，OA同軟骨細胞凋亡與增殖失衡關系密切。大量研究表明，OA患者有典型的軟骨細胞凋亡，凋亡數量與OA分級顯著相關[5]。bFGF對軟骨細胞既是絲裂原又是形態發生因子，對培養的關節軟骨細胞增殖及基質代謝有促進作用，隨培養基中bFGF的濃度增加，體外培養的軟骨細胞DNA含量明顯增加。當軟骨細胞生長、分裂活躍時，只有存在bFGF，才能維持軟骨細胞的表現型。bFGF甚至可將已成熟或轉化為成纖維細胞的細胞反分化為軟骨細胞[6]。研究表明，關節軟骨細胞bFGF-mRNA在兔實驗性OA關節軟骨原位表達，上調bFGF-mRNA表達，可減輕軟骨病變[7]。提示bFGF與OA關系密切。

近年研究發現，四環素類抗生素可抑制基質金屬蛋白酶、抑制一氧化氮生成，具有抗炎、免疫調節作用，并可作用于細胞因子網絡，其對OA軟骨的多途徑保護作用已得到證實[8]。本研究采取四環素作為陽性對照，結果發現，IL-6表達與軟骨病變相平行，呈顯著正相關，Fyc及四環素治療可降低IL-6表達、減輕軟骨病變，提示IL-6可作為OA監測病情嚴重程度的指標及治療的作用靶點。Fyc高、中、低劑量組之間，軟骨病變的Mankin’s評分差異具有顯著性（P＜0.05），隨Fyc劑量增加，大鼠OA病變減輕，提示其抗OA作用呈劑量依賴性。Fyc高劑量組bFGF表達顯著高于四環素組（P＜0.05），而二者軟骨病變、IL-6表達無顯著差異，Fyc高劑量組關節軟骨局部更高的bFGF水平未產生更強的促細胞增生及基質修復效果，可能提示bFGF對軟骨細胞的效應受多種因素影響，在OA治療中，單純增加病變關節局部bFGF水平所獲得的益處有一定的限度，不能有力阻止疾病進展。骨關節炎為損傷-修復性疾病，軟骨基質受損丟失、軟骨細胞凋亡及病理性過度修復增生同時存在，治療中應兩個方面同時兼顧。

綜上所述，IL-6及bFGF與OA密切相關，可作為治療的作用靶點。Fyc及四環素通過降低病變局部IL-6表達，上調bFGF表達而減輕OA軟骨基質降解，促進損傷修復，可能是其治療OA的重要機制之一。Fyc抗OA作用呈劑量依賴性，其作為一個療效肯定、無明顯不良反應的抗OA藥物，值得進一步臨床研究。

[1]王玉彬，陳安民，郭風勁，等.骨關節炎患者軟骨組織中TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-9的表達變化及意義[J].山東醫藥，2007，47（12）：11.

[2]趙承斌，陳 福.rhBMP和bFGF在大鼠關節軟骨損傷后的修復作用[J].哈爾濱醫科大學學報，2003，37（1）：25.

[3]Legendre F，Dudhia J，Pujol JP，et al.JAK/STAT but not ERK1/ERK2pathway mediates interleukin（IL）-6/soluble IL-6R down-regulation of typeⅡ collagen，aggrec-an core，and link protein transcription in articular chondrocytes：association with a down-regulation of SOX9expression[J].J Biol Chem，2003，278（5）：2 903.

[4]Jikko A，Wakisaka T，Lwamoto M，et al.Effects of interleukin-6 on proliferation and proteoglycan metabolism in articular chondrocyte cultures[J].Cell Biol Int，1998，22（9～10）：615．

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[7]唐 勇，姜 杰，孟 輝，等.補腎益氣活血方對兔實驗性膝骨關節炎軟骨細胞bFGF-mRNA表達的影響[J].云南中醫學院學報，2005，28（4）：24.

[8]王 君，何炳書，李笑萍.四環素對負重所致兔膝骨關節損傷的保護作用[J].中國老年學雜志，2007，1（27）：126.

Effects of Fuyuan Capsule on the Expression of Interleukin-6 and Basic Fibroblast Growth Factor in Rats with Experimental Osteoarthritis

LIANG Xiao-fang，LI Rong-heng，TANG Jing（Dept.of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

OBJECTIVE：To observe the effects of Fuyuan capsule on the expression of interleukin-6（IL-6）and basic fibroblast growth factor（bFGF）in rats with experimental osteoarthritis（OA）.METHODS：OA models were induced by Hulth technique.Model rats were randomly divided into six groups：control group，model group，tetracycline group，Fuyuan capsule high-dose，medium-dose and low-dose groups.Those groups were given relevant drug via i.g.gtt once a day for 10 weeks.Articular cartilages were obtained ten weeks later.Histomorphology of cartilage were evaluated according to macroscopic grading score and Mankin’s score was conducted.Expression of IL-6 and bFGF in articular cartilage were detected by immunochistochemistry technology.Pearson correlation analysis was carried out to determine Mankin’s index and the expression of IL-6 and bFGF in articular cartilage.RESULTS：Mankin’s score and the expression of IL-6 in Fuyuan capsule groups were lower than in model group（P＜0.01 orP＜0.05）；the expression level of bFGF in Fuyuan capsule groups were higher than in model group（P＜0.01）；there was significant difference in Mankin’s score among Fuyuan capsule groups（P＜0.05）.Pearson correlation analysis showed that the expression of IL-6 in the articular cartilage was positively correlated with the pathological change of joint（P＜0.01）.There was no significant correlation between the expression of bFGF in the articular cartilage and Mankin’s score.CONCLUSION：Fuyuan capsule can down-regulate the expression of IL-6 and up-regulate the expression of bFGF in dose-dependent manner.The treatment effect of high-dose Fuyuan capsule is identical to tetracycline in the treatment of OA.

Osteoarthritis；Fuyuan capsule；Interleukin-6；Basic fibroblast growth factor

R255.82；R97

A

1001-0408（2010）35-3287-03

2010-05-21

2010-06-08）