補(bǔ)腎健脾方對(duì)AD大鼠AchE、ChAT及海馬神經(jīng)元凋亡的影響

楊 帆,張 洪,許 旌,劉瑩露

阿爾茨海默病(AD)是一種中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,目前確切病因尚不清楚,但β淀粉樣肽誘導(dǎo)的乙酰膽堿酯酶(AchE)、膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)的活性改變及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的病理機(jī)制被廣泛接受。乙酰膽堿酯酶抑制劑(AchEIs)通過(guò)抑制AchE的活性,恢復(fù)乙酰膽堿(Ach)的正常水平,提高膽堿能神經(jīng)元的興奮性,從理論和臨床均已證明是有效的。而可減少神經(jīng)元凋亡的中藥制劑腦靈湯[1]及葛根素[2]已證明能顯著改善AD大鼠的學(xué)習(xí)及記憶能力。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)血清及腦組織中AchE及ChAT活性以及對(duì)海馬神經(jīng)元凋亡形態(tài)、調(diào)控蛋白的觀察,探討補(bǔ)腎健脾方對(duì)阿爾茨海默病的治療機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)SD雄性大鼠60只,3月齡～4月齡,體重250 g～300 g。由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。飼養(yǎng)條件:清潔級(jí),室內(nèi)溫度18℃～22℃,相對(duì)濕度 50%～70%,自由攝取水、食物。購(gòu)入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.1.2 藥物 補(bǔ)腎健脾復(fù)方制劑的主要成分是薏苡仁、淫羊藿等。采用不含賦形劑的浸膏,由江蘇省中醫(yī)院制劑室制備,批號(hào)20060721,每毫升含原藥0.9 g,藥物4℃保存。

1.1.3 主要試劑和儀器 乙酰膽堿酯酶、膽堿轉(zhuǎn)移酶的測(cè)定試劑盒及雙縮脲蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京生興生物公司,UV-722紫外分光光度計(jì)購(gòu)自上海第三分析儀器廠,80-1型離心沉淀機(jī)由上海手術(shù)器械廠提供。

1.2 方法

1.2.1 阿爾茨海默病模型的制備 腹腔注射氯胺酮25 mg/kg麻醉大鼠后,固定頭顱,以前囟為基點(diǎn),后移 0.5 mm,旁開(kāi) 2.8 mm,以牙科鉆鉆開(kāi)顱骨,雙側(cè)各注射鵝膏蕈氨酸(IBO)1 μ L(每側(cè)注射時(shí)間5 min,留針5 min)。假手術(shù)組同樣方法注射同體積生理鹽水。

1.2.2 分組及給藥 注射IBO后存活大鼠共27只,隨機(jī)分為模型組、補(bǔ)腎健脾復(fù)方制劑小劑量組(小劑量組)、補(bǔ)腎健脾復(fù)方制劑大劑量干預(yù)組(大劑量組)。假手術(shù)組9只大鼠全部存活,正常組預(yù)留大鼠8只。大劑量組灌服藥物濃度為7.2 g/(kg?d),小劑量組灌服藥物濃度為3.6 g/(kg?d),假手術(shù)組、模型組及正常組灌服同體積生理鹽水,連續(xù)4周。

1.2.3 取材及標(biāo)本采集 各組大鼠以2%的戊巴比妥60 mg/kg麻醉,取血后斷頭取海馬組織,部分液氮速凍后-80℃保存,部分用多聚甲醛固定后行冠狀切片,剩余組織用戊二醛固定后行電鏡檢查。

1.2.4 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法 采用Morris水迷宮。包括定位航行試驗(yàn):分別從池壁四個(gè)起始點(diǎn)將大鼠面向池壁放入池中,測(cè)其120 s內(nèi)成功進(jìn)駐平臺(tái)所需時(shí)間,如在120 s內(nèi)大鼠不能成功進(jìn)駐平臺(tái),則實(shí)驗(yàn)者將其引上平臺(tái)并令其停留10 s,記錄逃避潛伏期為120 s。空間探索試驗(yàn):試驗(yàn)最后1 d撤除平臺(tái),從原平臺(tái)象限對(duì)側(cè)池壁中點(diǎn)將大鼠放入水中,記錄大鼠120 s內(nèi)跨越原平臺(tái)位置的次數(shù)。

1.2.5 AchE、ChAT活性的檢測(cè) 將血清及海馬組織勻漿后稀釋,測(cè)定總蛋白濃度。按試劑盒步驟設(shè)定空白對(duì)照管及測(cè)定管,檢測(cè)樣品反應(yīng)體系混勻后用412 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。按公式測(cè)得AchE、ChAT的活性。

1.2.6 Bax、Bcl-2蛋白的檢測(cè) 免疫組化用 SP法。1∶400稀釋一抗,按SP試劑盒進(jìn)行操作,行DAB染色。陰性對(duì)照采用抗體稀釋液代替一抗進(jìn)行順序操作,未見(jiàn)細(xì)胞著色。每只實(shí)驗(yàn)大鼠取10張切片,光鏡下每張切片分別計(jì)數(shù)4個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞。取平均數(shù)作為陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.7 細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察 通過(guò)電鏡對(duì)各組大鼠的細(xì)胞器結(jié)構(gòu),尤其是細(xì)胞核的變化進(jìn)行觀察。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠的行為學(xué)改變(見(jiàn)表1) 模型組大鼠平均逃避潛伏期較正常組及假手術(shù)組明顯延長(zhǎng)(P＜0.05);大、小劑量組平均逃避潛伏期較模型組明顯縮短(P＜0.05)。撤除平臺(tái)后的空間探索試驗(yàn)中,模型組大鼠多在平臺(tái)所在的象限外游泳,而其他大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡多位于原平臺(tái)所在象限。模型組大鼠跨越原平臺(tái)位置次數(shù)較正常組及假手術(shù)組明顯延長(zhǎng)(P＜0.05);大、小劑量組跨越原平臺(tái)位置次數(shù)較模型組明顯縮短(P＜0.05),大劑量組的平均潛逃時(shí)間明顯短于小劑量組。

表1 各組大鼠的行為學(xué)改變( ±s)

表1 各組大鼠的行為學(xué)改變( ±s)

組別 鼠數(shù) 平均逃避潛伏期s跨越原平臺(tái)位置次數(shù)次正常組 8 4.31±0.68 7.33±0.33模型組 9 21.50±11.001) 3.75±0.481)假手術(shù)組 9 2.25±1.30 7.00±1.00小劑量組 9 5.31±1.402) 7.14±0.402)大劑量組 9 2.41±0.322)3) 6.67±0.672)與正常組及假手術(shù)組比較,1)P＜0.05;與模型組比較,2)P＜0.05;與小劑量組比較,3)P＜0.05

2.2 各組大鼠血清及海馬勻漿中AchE、ChAT活性的比較(見(jiàn)表2) 與對(duì)照組及假手術(shù)組比較,模型組大鼠海馬勻漿及血清中AchE的活性顯著升高,但ChAT活性明顯下降(P＜0.05)。與模型組比較,大、小劑量組大鼠血清及海馬勻漿中AchE活性下降,ChAT活性上升(P＜0.05)。大劑量組對(duì)ChAT的作用優(yōu)于小劑量組。

表2 各組大鼠血清及海馬勻漿中AchE、ChA T活性的比較( ±s)

表2 各組大鼠血清及海馬勻漿中AchE、ChA T活性的比較( ±s)

組別 鼠數(shù) AchE血清 勻漿ChAT血清 勻漿正常組 8 112.4±4.5 235.7±8.4 2 378±43 4 869±78模型組 9 154.8±5.41) 153.6±12.01) 1 486±261) 2 749±631)假手術(shù)組 9 110.2±6.1 263.7±11.0 2 538±59 4 596±82小劑量組 9 135.6±7.42) 453.7±13.02) 2 395±392) 4 293±842)大劑量組 9 129.4±6.92) 473.4±14.02) 2 669±472)3) 4 746±692)3)與正常組及假手術(shù)組比較,1)P＜0.05;與模型組比較,2)P＜0.05;與小劑量組比較,3)P＜0.05

2.3 各組大鼠海馬中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的比較(見(jiàn)表3)AD大鼠海馬中Bax陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量較正常組及假手術(shù)組增加(P＜0.05),而B(niǎo)cl-2陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量則有所減少(P＜0.05)。與模型組比較,大、小劑量組Bax陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯著減少(P＜0.05),Bcl-2陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量明顯增加。大、小劑量組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 各組大鼠海馬中陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量的比較( ±s)

表3 各組大鼠海馬中陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量的比較( ±s)

組別 鼠數(shù) Bax Bcl-2正常組 8 6.12±1.23 6.78±1.76模型組 9 15.50±2.731) 10.40±3.531)假手術(shù)組 9 6.75±1.54 7.45±2.75小劑量組 9 10.30±3.832) 16.20±4.712)大劑量組 9 9.24±2.942) 15.90±3.972)與正常組及假手術(shù)組比較,1)P＜0.05;與模型組比較,2)P＜0.05

2.4 電鏡觀察 模型組大鼠海馬中細(xì)胞核膜增厚,核形態(tài)不規(guī)則,核內(nèi)染色質(zhì)濃縮,高爾基復(fù)合體和尼氏體減少,脂褐素沉著,部分線粒體腫脹或呈空泡樣變性。而正常組、假手術(shù)組、大劑量組、小劑量組大鼠的海馬細(xì)胞中均未見(jiàn)以上細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變。

3 討 論

近年來(lái)研究表明,AD病人早在出現(xiàn)臨床癥狀或典型病理改變之前數(shù)年,腦組織中即開(kāi)始出現(xiàn)β淀粉樣蛋白(Aβ)的蓄積[3]。Aβ是由淀粉樣蛋白前體蛋白裂解產(chǎn)生的一個(gè)片段,含有39個(gè)～43個(gè)氨基酸,對(duì)神經(jīng)元具有毒性作用。是誘發(fā)AD各種病理生理機(jī)制中的共同通路,是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素。其神經(jīng)毒性包括激活細(xì)胞自身基因程序引起神經(jīng)元凋亡[4]、影響生物酶導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)元退化兩個(gè)方面。

膽堿能系統(tǒng)以Ach為主要神經(jīng)遞質(zhì),其生理作用主要通過(guò)兩種生物酶起作用。其中ChAT是Ach的生物合成酶,存在于膽堿能神經(jīng)元中,是衡量膽堿能神經(jīng)元功能的標(biāo)志[5];而AchE可水解Ach,在AD病人腦組織中的總體活性下降,但在Aβ板塊內(nèi)及周?chē)M織中的AchE活性卻異常增加。其機(jī)制可能為Aβ的直接刺激,或是高濃度 Aβ誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡表達(dá)了過(guò)多的AchE所致[6]。病人腦內(nèi)ChAT活性下降及AchE活性增高是引起膽堿能神經(jīng)元功能退化的主要原因之一,因此被認(rèn)為是AD的標(biāo)志性生化特征[7]。

除改變ChAT和AchE的活性外,Aβ還可以通過(guò)調(diào)節(jié)原癌基因、死亡受體、細(xì)胞色素酶及增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度等多種因素激活細(xì)胞凋亡引起神經(jīng)元的功能減退[8,9]。其中對(duì)原癌基因Bcl-2及Bax的調(diào)節(jié)為最主要的途徑之一。Bcl-2基因廣泛存在于大腦皮層和海馬組織中,其表達(dá)產(chǎn)物Bcl-2具有抗凋亡作用,其在AD腦中的表達(dá)較高,是通過(guò)抗氧化作用對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用。而B(niǎo)ax基因的表達(dá)產(chǎn)物具有促進(jìn)凋亡的作用,在體內(nèi)與Bcl-2形成二聚體而失活,從而抑制細(xì)胞凋亡。在正常人腦組織中Bax/Bcl-2形成平衡體系,而AD病人腦組織中則Bax表達(dá)上調(diào),Bcl-2表達(dá)下降,可促進(jìn)神經(jīng)元凋亡,加速神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示 AD大鼠模型大腦海馬組織中 AchE、ChAT的活性改變,Bax/Bcl-2的表達(dá)失調(diào)及大量細(xì)胞凋亡,這可能由于Aβ在海馬部位沉積較多有關(guān),與AD病人死后大腦海馬凋亡神經(jīng)元凋亡明顯增高的研究[10]相符。補(bǔ)腎健脾復(fù)方制劑大、小劑量干預(yù)組AchE活性下降、ChAT活性上升及Bax/Bcl-2表達(dá)趨向平衡,提示這三種調(diào)節(jié)方式可能為補(bǔ)腎健脾方對(duì)阿爾茨海默病的治療機(jī)制。

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