諾氟沙星-釹金屬配合物的合成，表征及其與DNA作用的研究

張寶秀，周成勇

（長治學院，山西 長治 046011）

諾氟沙星-釹金屬配合物的合成，表征及其與DNA作用的研究

張寶秀，周成勇

（長治學院，山西 長治 046011）

首次合成了稀土金屬釹與氟喹諾酮類藥物-諾氟沙星的配合物，并應用熒光光譜法、DNA的熱變性和黏度等方法，對該金屬配合物與小牛胸腺DNA作用方式進行了研究。配合物與DNA作用時，熒光不發(fā)生淬滅，黏度減小；熱變性溫度基本保持不變；Scatchard圖表明配合物對溴化乙錠（EB）與DNA的結(jié)合為非競爭性抑制。實驗結(jié)果一致表明該金屬配合物與DNA作用方式為靜電結(jié)合。

諾氟沙星；釹；小牛胸腺DNA；靜電結(jié)合

氟喹諾酮類藥物是DNA拓撲異構(gòu)酶II（TopoisomNbase II）的抑制劑，能夠選擇性地作用于原核生物的拓撲異構(gòu)酶。DNA的回旋酶的兩條鏈在解開之后，使得藥物分子鑲嵌在非配對堿基上，阻礙兩條鏈進一步結(jié)合。諾氟沙星（Norfloxacin）是第三代喹諾酮類的代表藥物之一[1，2]，是喹啉的衍生物，具廣譜抗菌作用，尤其對需氧革蘭陰性桿菌的抗菌活性高，對腸桿菌科的大部分細菌，包括枸椽酸桿菌屬、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌等腸桿菌屬、大腸埃希菌、克雷伯菌屬、變形菌屬、沙門菌屬、志賀菌屬、弧菌屬、耶爾森菌等在體外具良好抗菌作用。諾氟沙星體外對多重耐藥菌亦具抗菌活性。對青霉素耐藥的淋病奈瑟菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌亦有良好抗菌作用。諾氟沙星作為殺菌劑，通過作用于細菌DNA螺旋酶的A亞單位，抑制DNA的合成和復制而導致細菌死亡。而金屬離子對該類藥物在體內(nèi)的活性有重要影響，許多金屬離子可與喹諾酮分子中的3位羧基和4位酮基配位形成配合物。對喹諾酮與金屬離子配合物的合成和結(jié)構(gòu)以及性質(zhì)方面的研究已有不少文獻報道，并有文獻報道了部分配合物的抗菌活性[3-6]，但該類配合物與DNA的作用及其抗腫瘤活性卻鮮有報道[7]。生物學只有深入到分子水平，才能從本質(zhì)上探討生命體系活動的規(guī)律。目前，已有不少學者對氟喹諾酮與金屬離子的配位化學進行了研究[8-16]。稀土配合物能否作為治療腫瘤的藥物是人們一直關心的問題，曾有一些探索性的研究報道，發(fā)現(xiàn)低劑量的稀土配合物對腫瘤細胞有抑制作用[17]。諾氟沙星，其化學名稱為：1-乙基-6-氟-1,4-二氫-4-氧代-7-（1-哌嗪基）-3-喹啉羧酸，（其結(jié)構(gòu)見圖1），因其抗菌譜較廣，過敏反應少，毒副作用輕，已被廣泛應用于臨床。因此本文合成了稀土釹離子與諾氟沙星的金屬配合物（Norf-Nd），并從分子水平研究了該金屬配合物與DNA的相互作用。文章旨在為進一步開發(fā)諾氟沙星的藥用價值以及探索其金屬配合物的抗腫瘤活性提供一定的理論基礎。這對于了解喹諾酮類藥物在人體內(nèi)與DNA的結(jié)合方式及藥理作用等具有現(xiàn)實意義。

圖1 諾氟沙星（Norfloxacin）的結(jié)構(gòu)

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

Themofinnigan Polaris質(zhì)譜儀，Perkin-Elmer 2400型元素分析儀，Bruker DRX-300 MHz核磁共振儀，Shimadiu-FfIR-8300紅外儀（KBr壓片），Perkin-Elmer LS-50B型熒光光譜儀，Hewlett-Packard 8453型紫外分光光度計，BECKMANΦ50pH計，Ubbelodhe黏度計。

小牛胸腺DNA（華美生物工程公司），溶液純度以A260 nm/A280 nm>1.8衡量，濃度以260 nm處的吸光度來確定（ε=6600 L.mol-1.cm-1），于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫痪彌_液由0.1 MTris溶液和0.1 M鹽酸配制（pH=7.2）；諾氟沙星（中國藥品生物制品檢定所）；溴化乙啶（EB）（舒伯韋公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 熒光光譜

固定DNA濃度為12μM，EB濃度為5μM，然后以不同的R（cNd-Norf/cDNA）加入配合物。室溫下反應30min，然后以激發(fā)波長 520 nm，狹縫Ex=Em=10 nm，在540 nm-720 nm范圍內(nèi)進行掃描。在作Scatchard圖時，固定DNA濃度為2.5μM，配合物濃度依次增大，室溫下反應30 min，用100μg/mLEB溶液滴定，激發(fā)波長520 nm，狹縫Ex=Em=10 nm。數(shù)據(jù)按Scatchard方程[18]處理，以r/c對r作圖（r是與DNA分子中每個核苷酸成鍵的EB分子數(shù)，c是游離EB的濃度）。

1.2.2 黏度測定

小牛胸腺DNA濃度固定為5.0×10-5M，配合物濃度依次增大，溫度恒定在（25士0.1）℃，反應30 min，然后用烏氏黏度計進行測量。數(shù)據(jù)以（η/η0）1/3對配合物濃度作圖。η0代表DNA單獨存在時的黏度，η代表DNA與配合物作用后黏度。

1.2.3 熱變性研究

配制DNA-EB溶液（cDNA/cEB=20）和DNA-EB-Nd-Norf溶液（cDNA/cEB=20，cEB=cNd-Norf），用 Shimadzu循環(huán)水浴控制樣品槽的溫度從25-95℃，在波長260 nm處每隔5℃測定一次樣品的紫外吸收。

1.3 配合物的合成

攪拌下，將NdCl3（0.5012 g，2.0 mmol）溶于10 mL水的溶液逐滴加入到諾氟沙星（1.277 g，4.0 mmol）溶于10 mL HCI（0.1 M）的溶液中，滴加完畢后，在反應混合液中加入10 mL甲醇和10mLNaOH（0.1 M）溶液，在室溫下攪拌過夜，則生成白色沉淀，過濾后，固體用甲醇洗滌3次。最后再將所得固體用熱甲醇-水（1：1）做溶劑進行重結(jié)晶，真空干燥，得到配合物的白色固體。

1.4 配合物的表征

1.4.1 一般性質(zhì)分析

配合物在水中的溶解度大于諾氟沙星；配合物熔點＞250℃（諾氟沙星熔點為228℃）。測定配合物的摩爾電導率為 139.2 s cm2mol-1，說明配合物是 1：2型的[19]。

1.4.2 IR圖譜分析

配合物與諾氟沙星的主要IR吸收峰對比如表1所示。

表1 配合物與諾氟沙星主要IR吸峰對比

比較二者的主要紅外吸收峰，可以發(fā)現(xiàn)在諾氟沙星配體的IR譜圖中有兩個很強的吸收峰，即1720 cm-l（COOH）和1620 cm-l（C=O），而在配合物的IR譜中，1720 cm-l吸收峰消失，1620 cm-l處的強吸收峰并沒有改變。另外，配合物在1560 cm-1和1390 cm-1處出現(xiàn)2個吸收峰。根據(jù)文獻[20]我們知道羧基負離子-COO-在1610-1550 cm-l和1400 cm-1左右可出現(xiàn)2個吸收峰和。因此我們可以判斷配體諾佛沙星和金屬Nd3+是以雙齒進行配位，這和1720 cm-l處強吸收峰的消失也是一致的。另外，由于羧基負離子-COO-中兩個C-O鍵的共軛關系使得兩個C-O鍵發(fā)生平均化，新的振動吸收峰在550 cm-l出現(xiàn)，因此我們可將其歸屬于Nd-O鍵。

1.4.3 H1NMR分析

諾氟沙星的 H1NMR中質(zhì)子的 δ 值為[21]：1.51（3H，CH3），3.61（8H，哌 嗪 CH2），4.42（2H，CH2），7.02（1H，8-H），7.30（1H，5-H），8.58（1H，2-H），和 10.08（1H，COOH）。在配合物的H1 NMR譜中，除δ10.08的吸收峰消失外，其它吸收峰的δ值變化不大（＜0.2 ppm.）。

1.4.4 元素分析和質(zhì)譜分析

元素分析：理論值（%），C，45.09；N，9.86；H，4.49。測定值（%），C，45.06；N，9.82；H，4.52。 質(zhì) 譜 分 析 MS（FAB）m/z（%）：852.37（M+，100.0）。

1.4 配合物的結(jié)構(gòu)

根據(jù)以上測定數(shù)據(jù)推斷配合物Nd-Norf的可能結(jié)構(gòu)為圖2

圖2 配合物Nd-Norf的推斷結(jié)構(gòu)

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜研究

2.1.1 配合物對DNA-EB熒光光譜的影響

溴化乙錠（EB）為一共扼平面分子，本身熒光很弱，但能專一性地插入DNA雙螺旋或三螺旋內(nèi)部的堿基對之間使熒光顯著增強，當配合物以插入方式與DNA結(jié)合時，EB會從DNA堿基對中被擠出，熒光發(fā)生猝滅；若為靜電結(jié)合，EB則不會被擠出，熒光不發(fā)生淬滅。因此EB可作為DNA的結(jié)構(gòu)探針[22]。由圖3可看出，在緩沖溶液中，隨著Nd-Norf配合物濃度的不斷增加，DNA-EB熒光基本不變，說明Nd-Norf配合物與DNA是以靜電方式相互作用。

2.1.2 配合物對DNA-EB抑制作用類型分析

利用配合物存在下DNA與EB作用的Scatchard圖可判別配合物的作用方式[23]。如圖4，在不同濃度的配合物存在下，Scatchard圖是幾條平行線，表明隨著配合物濃度的增大，DNA與EB的結(jié)合常數(shù)和鍵合位點數(shù)都沒發(fā)生改變，證明配合物與EB在DNA上的結(jié)合位點是非竟爭型的，從而表明Nd-Norf配合物與DNA是以靜電方式相互作用。

圖3 EB-DNA復合物與Nd-Norf配合物作用的熒光光譜[Nd-Norf]/[DNA-EB]=0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 。

圖4 不同濃度的[Nd-Norf]存在下DNA與EB作用的Scatchard圖[DNA]=2.5μM從上到下[Nd-Norf]/[DNA]=0，0.25，0.5，1.0.

2.2 黏度研究

具有光學活性的光物理探針對于探討鍵合模式一般可提供必要但不是充分的證據(jù)[24]。在缺乏晶體數(shù)據(jù)的情況下，黏度測定一般被認為是確定鍵合模式最有力的證據(jù)之一[25]。

黏度對分子長度變化非常敏感。當小分子配合物以經(jīng)典插入方式與DNA相互作用時，DNA相鄰堿基對的距離會增大以容納插入的配合物分子，導致DNA螺旋伸長，相應DNA黏度增加。DNA本身是一多聚陰離子，在溶液中，由于負電荷之間的相互靜電排斥，使DNA大分子較為伸展。而當配合物陽離子與DNA帶負電荷的磷酸氧基團以靜電作用結(jié)合時，使得DNA的負電荷被部分中和，導致DNA螺旋收縮，分子長度變小，相應DNA黏度降低。從圖5可以看出，DNA與Nd-Norf配合物相互作用后，DNA黏度值隨配合物濃度的增加而降低，因此進一步確定了Nd-Norf配合物是以靜電方式與DNA相互作用。

2.3 配合物與CT-DNA作用的熱變性實驗

通過測定DNA的熱變性溫度（tm）可以判斷配合物與DNA的作用模式。配合物與DNA發(fā)生插入作用時，將穩(wěn)定DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，并使tm急劇上升；而配合物僅與DNA通過靜電作用發(fā)生外部鍵合時，則tm上升幅度較小（一般<0.6℃）或不上升[26]。如圖6所示，在本實驗條件下，DNA的tm為80℃（a），而當DNA與配合物Nd-Norf作用后，其tm仍為80℃（b），其熱變性溫度（tm）并未發(fā)生改變。這一現(xiàn)象又進一步表明Nd-Norf配合物是通過靜電方式和DNA相互作用。

圖5 隨配合物濃度增加DNA的黏度變化圖[Nd-Norf]=0，0.5，1.0，1.5，2.0μM

圖6 DNA熱變性曲線圖

3 結(jié)論

綜上所述，文章合成了新的諾氟沙星-釹金屬配合物,并應用熒光光譜法、DNA的熱變性和黏度等方法，對該金屬配合物與小牛胸腺DNA作用方式進行了研究。配合物與DNA作用時，熒光不發(fā)生淬滅，DNA的熱變性溫度不變，黏度降低，Scatchard圖表明配合物對溴化乙錠（EB）與DNA的結(jié)合為非競爭性抑制。這些實驗結(jié)果都一致表明，諾氟沙星-釹金屬配合物與DNA作用方式為靜電結(jié)合，即配合物通過其金屬離子所帶的正電荷與DNA磷酸骨架上磷酸基所帶的負電荷相互作用。本研究從分子水平為進一步開發(fā)諾氟沙星的藥用價值以及探索其金屬配合物的抗腫瘤活性提供了一定的理論基礎。

［1］Buckton G,Russel S J，Beezer A E.On the Curracy of Results forMMicrocalorimetric Measurements on Cellular systems［J］.ThermochiMActa，1991，6（22）：193-195.

［2］Hao Li-xia，Li Bao-xin，Zhang zhu-jun.Interaction of Norfloxacin with Bovine SeruMAlbumin［J］.Journal of Shaanxi Normal University （Natural Science Eition），2002，30（2）：73-75（Ch）.

［3］RUIZ M， PERELLOL，ORTIZ R，et a1.Synthesis，characterization， and crystal structure of ［Cu（cinoxacinate）2］·2H2O complex：A square-planar CuO4 chromophore.antibacterial studies［J］.J.lnorg.Bioehem.，1995，（59）：801-810.

［4］GAO Fei， YANG Pin， XIE Jun， et a1.Synthesis，characterization and antibacterial activity of novel Fe（Ⅲ），Co（Ⅱ），and Zn（Ⅱ）complexes with norfloxacin［J］.J.lnorg.Biochem.，1995，（60）：61-67.

［5］TUREL I，LEBAN I，KLINTSCHAR G，et a1.Synthesis，crystal structure，and characterization of two metalquinolone compounds［J］.J.lnorg.Biochem.， 1997，（66）：77-82.

［6］TUREL I，LEBAN I，BUKOVEC N.Crystal structure and characterization of the bismuth（Ⅲ）compound with quinolone familymember（ciprofloxacin）antibactrial study［J］.J.lnorg.Bioehem.，1997，（66）：24l-245.

［7］王國平，朱龍觀，俞慶森.含氟喹諾酮雙核銅（II）配合物的合成、晶體結(jié)構(gòu)和生物活性［J］.無機化學學報，2003，19（2）：179-182．W ANGGuo-ping，ZHULong-guan，YU Qingsen. Synthesis， crystal structure， antibacterial and antitumor activities of a new binuclear copper（Ⅱ）complexcontaining fluoroquinolone［J］.Chin J.Inorg.Chem.，2003，19（2）：179-182.

［8］WALLIS S C，GAHAN L R，CHARLES B G，eI a1.Copper（ Ⅱ） complexes of the fluoroquinolone antibacterial ciprofloxacin synthesis，X-ray structural characterization，and potentiometric study［J］.J.Inorg.Biochem.，1996，6（2）：1-16.

［9］YANG Pin，LI Jia-bin，TIAN Yan-ni，et a.Synthesis and crystal structure of rare earth complex with ciprofloxacin［J］.Chin Chem.Lett.，1999，10（10）：879-880.

［10］TUREL I，GOLIC L，BUKOVEC P，et a1.Antibacterial tests of bismuth （II） -qinolone （ciprofloxacin， cf）compounds against helicobacter pylori and some other bacteria crystal structure of （cfH2）2［Bi2C1l0］·4H2O［J］.J.Inorg.Biochem.，1998，（71）：53-60.

［11］PRASANNA MD， GURU R T.Hydrogen bonded networks in hydrophilic channels：crystal structure of hydrated ciprofloxacin lactate and comparison with structurally similar compounds ［J］. J. Molecular Structure，2001，559：255-261.

［12］TUREL I，GOLIC，RAMIREZ O L R.Crystal structure and characterization of a new copper（Ⅱ）-ciprofloxacin（cf）complex［Cu（cf）（H2O）3］SO4·2H2O［J］.Acta ChiMSlov，199，46（2）：203-211.

［13］WANG Guo-pin，ZHU Long-guan.Synthesis and crystal structure of a new copper（Ⅱ）complex containing fluoroquinolone ［A］.Frontiers of Solid State Chemistry［C］.Singapore：World Scientific Press，2002，327-331.

［14］TUREL I，BUKOVEC N，F(xiàn)ARKASE.Complex formation between some metals and quinolone family member（ciprofloxacin） ［J］.Polyhedron，1996，15 （2）：269-275.

［15］王國平，雷群芳.氟哌酸銅配合物的合成、電子順磁共振波譜與抗菌活性［J］.浙江大學學報（理學版），2003，30（2）：92-96.W ANG Guo-ping，LEIQun-fang.Synthesis，electron paramagnetic resonance properties and antibacterial studies of copper（Ⅱ）complex containing norfloxacin ［J］. Journal of Zhejiang University（Science Edition），2003，30（2）：92-96.

［16］王國平，蔡國強，朱龍觀．具二維網(wǎng)格的氟喹諾酮類配合物的合成和晶體結(jié)構(gòu)［J］. 無機化學學報，2000，16（6）：987-990．WANG Guo-ping， CAI Guo-qiang， ZHU Longgua.Synthesis and crystal structure of fluroquinolone complex of copperwith two-dimension network［J］.China J.Inorg.Chem.，200，16（6）：987-990.

［17］王宗惠，蘇英，龐新民．混合硝酸稀土對人正常細胞及癌細胞生長作用的體外觀察［J］.衛(wèi)生毒理學雜志，1994，8（3）：197-199．WANG Zong-hui，SU Yin，PANG Xinmin.In vitro examination of inhibitory activity of mixed nitrate of rare earth compounds against human normal celland cancer cell Lines［J］.J.Health Toxicology，1994，8（3）：197-199.

［18］YANG P，GUO ML.Interaction of some non-platinuMmetal anticancer complexeswith nucleotides and DNA and Two-Pole Complementary Principle （TPCP） arising therefrom［J］.Metal Based Drugs 1998，（5）：41-58.

［19］Geary WJ.The use of conductivity measurements in organic solvents for the characterisation of coordination compounds：［J］Coord.Chem.Rev.1971，7（1）：81-122.

［20］NakashiK，Solomon PH.Infrared Adsorption Spectroscopy，translated into Chinese by C.Wang［J］Chinese Academic Press，Peking，1984，Ch.2.

［21］Kaga H，Itoh A，Murayama S，Suzue S，Irikura T.Structure-activity relationships of antibacterial 6，7-and 7，8-disubstituted1-alkyl-1，4-dihydro-4-oxoquinoline-3-carboxylicacids.J.Med.Chem.1980，23（12）：1358-1363.

［22］Mulqueen，P.，Tingey，J.M.；Horrocks，W.D..［J］ Biochemistry 1985，（24）：6639-6645.

［23］M.F.Tweedle，L.J.Wilson［J］.J.Am.Chem.Soc.1976，（98）：4824-4833.

［24］Sigman，D.S.；Mazumder，A；Perrin，D.M..［J］Chem.Rev.1993，（93）：2295-2316.

［25］Satyanarayana，S.；Dabrowiak，J.C.；Chaires，J.B..［J］Biochemistry 1992，31（39）：9319-9324.

［26］靳蘭，楊頻，李青山.熒光法研究手性金屬配合物與DNA 的作用機理［J］. 高等學校化學學報，1996，（17）：1345-1348.

Abstract：A new Nd（Ⅲ）complex of Nd-Norf（here，Norf=Norfloxacin）have been synthesized and characterization.Its interaction with calf thymus DNA has been firstly investigated using fluorescent spectra，thermal denaturation and viscosity measurements.The experimental results show conformably that the mode of binding of the complex Nd-Norf to DNA is unclassical electrostatic action.

Keywords：DNA-binding；neodymium；Norfloxacin；calf thymus DNA

（責任編輯 王璟琳）

Synthesis，Characterization and Studieson DNA-binding of a New Nd（Ⅲ）Complex with Norfloxacin

ZHANG Bao-xiu，ZHOU Cheng-yong
（Changzhi University，Changzhi，Shanxi046011）

R914

A

1673-2014（2010）05-0008-05

2010—06—27

張寶秀（1964— ），女，山西陵川人，高級工程師，主要從事藥物化學方面的研究。