健脾止瀉顆粒對脾虛證及抗生素腸道＊菌群失調模型小鼠的微生態調節作用

李秋明，張亞杰，張大方，劉 佳，李麗靜

（長春中醫藥大學，吉林 長春 130117）

健脾止瀉顆粒是以黃連、白術等6味藥為組方的健脾止瀉藥，臨床主治脾腎虛寒型泄瀉。為觀察其藥效作用，我們進行了以苦寒瀉下中藥大黃造成小鼠脾虛模型，選用厭氧及需氧菌選擇性培養基測定糞便中代表性菌種含量，以鹽酸林可霉素造成腸道菌群失調模型，選用厭氧及需氧菌選擇性培養基測定糞便中代表性菌種含量等實驗模型觀察健脾止瀉顆粒對腸道菌群的影響，現報道如下。

1 實驗材料

1.1 動物

昆明種小白鼠，雌雄各半，體重20g±2g，由吉林大學基礎醫學院實驗動物中心提供，動物合格證號為 SCXK-（吉）2008-0001。

1.2 藥物

健脾止瀉顆粒由課題制劑組提供，規格為0.5g/片，每克含生藥4g，批號20090311。使用時用生理鹽水制成混懸液滅菌后4℃保存備用；大黃：蓼科植物唐古特大黃，水煎成1ml含1g生藥的水煎液，滅菌后4℃保存備用；麗珠腸樂購于吉林省吉深藥店，麗珠醫藥集團股份有限公司生產，批號090321；硫酸慶大霉素注射液為天津藥業集團新鄭股份有限公司，8萬單位/支，0908271。

1.3 培養基

雙歧桿菌培養基（BS）、乳桿菌培養基（LBS）、伊紅美蘭平板（EMB）、葡萄球菌選擇培養基（SP）均購于青島海博生物技術有限公司。細菌培養用營養瓊脂、營養肉湯（北京奧博星生物技術有限責任公司）。

1.4 菌株

大腸埃希菌（ATCC44102）、銅綠假單胞菌（ATCC27853）、痢疾桿菌（ATCC27336）、金黃色葡萄球菌（ATCC26003）均購于中國藥品生物制品檢定所，為本室保藏。

1.5 儀器

全溫振蕩培養箱（哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司，HZQ-F160）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司，DHG-9123A）；手提式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業有限公司，YXQ-LS-18SL）；超凈工作臺；金屬單道移液器（丹麥Cappelen，CappAero）；分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，AL204）；磁力加熱攪拌器（國華電器有限公司，78-1）。

2 方法與結果

2.1 健脾止瀉顆粒對脾虛小鼠腸道菌的影響

2.1.1 分組及造模 將雌雄小白鼠隨機分成正常對照組、造模組、陽性對照組與健脾止瀉顆粒高、中、低治療組，每組6只，雌雄各半。除正常對照組外，其余各組依文獻［1］所述脾虛造模方法灌胃大黃煎汁造模7d，獲得脾虛證模型。然后各組分別以0.5、1、2mg/kg劑量灌胃健脾止瀉顆粒7d。造模組同期灌胃生理鹽水，陽性對照藥給予麗珠腸樂。

2.1.2 標本采集與培養 按摩小白鼠腹部促其排便，將糞便置于無菌紙上稱量后迅速轉移至滅菌研瓶內搗碎，然后用無菌生理鹽水做對數稀釋。取10倍連續稀釋液，用微量移液器取20μl滴于培養基表面，然后迅速置于厭養培養箱中培養72h。腸道需氧菌群檢測時糞便標本依預試結果選取10－3、10－4、10－5、10－6稀釋度，接種后在需氧條件下37℃培養24h之后計數典型菌落。

進行雙歧桿菌、乳桿菌、腸桿菌、腸球菌的培養和菌落計數。各種菌培養方法如下。雙歧桿菌：BBL瓊脂，37℃ 48h～72h厭氧培養；乳桿菌：LBS瓊脂，37℃ 48h培養；腸桿菌：EMB瓊脂，37℃24h～48h培養；腸球菌：Ec瓊脂，37℃ 24h～48h培養。

2.1.3 統計方法 每克標本的菌落數=典型菌落數÷稀釋度 ×50。檢測值一般較大，為計算方便將其轉換為對數值，即lgCFU/g形式。應用SPSS統計軟件進行統計學處理。

2.1.4 實驗結果

一般體征：造模鼠自第2天起開始出現軟泥樣便，第5天出現腹瀉便溏、食欲不振、畏寒扎堆等脾虛癥狀。隨著造模的進行上述癥狀逐漸加重。造模1周后自然恢復鼠的脾虛證狀基本保持不變。健脾止瀉顆粒治療組隨著治療的進行，脾虛證狀明顯改善，至服藥完畢時一般體征恢復正常。

表1 健脾止瀉顆粒對脾虛小鼠腸道厭氧菌的影響±s，n=6）

表1 健脾止瀉顆粒對脾虛小鼠腸道厭氧菌的影響±s，n=6）

注：與正常對照組比較：###P＜0.01，＊＊＊P＜0.001，△△P＜0.01，*P＜0.05

組別 劑量（g/kg）雙歧桿菌lgCFU/g乳桿菌lgCFU/g正 常 對 照 組10.335±0.129 10.274±0.065模 型 對 照 組 9.787±0.035### 9.962±0.076###麗 珠 腸 樂 組 10.929 ±0.074＊＊＊ 10.536 ±0.041＊＊＊健脾止瀉顆粒高劑量組 2 10.108±0.100＊＊＊ 10.207±0.076＊＊健脾止瀉顆粒中劑量組 1 10.014±0.440＊＊ 10.076±0.049*健脾止瀉顆粒低劑量組 0.5 9.978±0.208*9.997±0.063

表2 健脾止瀉顆粒對脾虛小鼠腸道需氧菌的影響±s，n=6）

表2 健脾止瀉顆粒對脾虛小鼠腸道需氧菌的影響±s，n=6）

注：與正常對照組比較：△△P＜0.01，*P＜0.05

組別 劑量（mg/kg）腸桿菌lgCFU/g腸球菌lgCFU/g正 常 對 照 組7.075±0.029 6.528±0.033模 型 對 照 組 7.393±1.061### 6.555±0.023#麗 珠 腸 樂 組 7.378±0.046 6.532±0.022健脾止瀉顆粒高劑量組 2 7.165±0.034＊＊＊ 6.377±0.076＊＊健脾止瀉顆粒中劑量組 1 7.344±0.082* 6.508±0.051*健脾止瀉顆粒低劑量組0.5 7.386±0.046 6.529±0.050

2.2 健脾止瀉顆粒對抗生素引起小鼠腸道菌失調的影響

2.2.1 分組及造模 將雌雄小白鼠隨機分成造模組與治療組，每組6只，雌雄各半。依文獻［1］所述抗生素引起小鼠腸道菌失調模型為每天灌胃鹽酸林可霉素0.2ml/只，造模5d，獲得抗生素引起小鼠腸道菌失調模型。然后按2、1、0.5g/kg劑量灌胃健脾止瀉顆粒7d。造模組同期灌胃生理鹽水，使其成為自然恢復對照組。

2.2.2 標本采集與培養（同2.1.1）

2.2.3 統計方法（同2.1.3）

2.2.4 實驗結果 一般體征：各組動物外觀體征沒有明顯區別，飲食、毛板、活動、體重增長情況均無明顯差異。

表3 健脾止瀉顆粒對抗生素菌群失調模型小鼠腸道厭氧菌的影響±s，n=6）

表3 健脾止瀉顆粒對抗生素菌群失調模型小鼠腸道厭氧菌的影響±s，n=6）

注：與正常對照組比較：△△P＜0.01，*P＜0.05

組別 劑量（mg/kg）雙歧桿菌lgCFU/g乳桿菌lgCFU/g正 常 對 照 組10.411±0.072 10.274±0.053模 型 對 照 組 9.484±0.116###△△ 9.654±0.049△△麗 珠 腸 樂 組 9.770±0.099＊＊ 10.175±0.114＊＊健脾止瀉顆粒高劑量組 2 9.604±0.037* 9.669±0.051健脾止瀉顆粒中劑量組 1 9.538±0.053 9.605±0.081健脾止瀉顆粒低劑量組0.5 9.530±0.056 9.595±0.032

3 討論

泄瀉可能為外邪（主要是致病菌）入侵或體虛引起，而脾虛泄瀉主要由正氣虛而外邪入引起。已有學者運用微生態學理論與方法去詮釋。中醫脾胃理論研究證實，大黃脾虛模型小鼠腸道菌群失調，健脾方藥具有一定的調整菌群失調作用［1、2］。健康人體或動物胃腸道存在著龐大的菌庫，同脾胃系統乃至整個機體有著實質性的相互依存性。腸道微生態體系在生理狀態下對人體具有藥物活化、免疫激活、生物拮抗、解毒與營養等功能，而病理狀態下則成為內源性感染或耐藥性的根源［3～6］。西醫各科與微生態學相結合的腸道菌群研究取得了長足進步，中醫藥與微生態學的結合研究已有起步。為此，探討健脾止瀉藥健脾止瀉顆粒對苦寒瀉下藥物及腸道菌群影響的微生態調節作用，為健脾止瀉顆粒的藥效機制提供了實驗依據。由于臨床可見部分患者長期應用抗生素，導致腸內菌群失調后長期泄瀉，因此選擇林可霉素造成抗生素型菌群失調模型，以探討健脾止瀉顆粒是否具有一定的治療作用。

表4 健脾止瀉顆粒對抗生素菌群失調模型小鼠腸道需氧菌的影響±s，n=6）

表4 健脾止瀉顆粒對抗生素菌群失調模型小鼠腸道需氧菌的影響±s，n=6）

注：與正常對照組比較：△△P＜0.01，*P＜0.05

組別 劑量（mg/kg）腸桿菌lgCFU/g腸球菌lgCFU/g正 常 對 照 組7.087±0.049 6.510±0.034模 型 對 照 組 6.464±1.036### 5.511±0.031麗 珠 腸 樂 組 6.449±0.061 5.514±0.036健脾止瀉顆粒高劑量組 2 6.414±0.088 5.512±0.018健脾止瀉顆粒中劑量組 1 6.423±0.055 5.515±0.027健脾止瀉顆粒低劑量組0.5 6.418±0.061 5.510±0.048

選用大黃脾虛造模后發現，模型存在顯著的微生態失調，所檢測的2種腸道厭氧菌均有不同程度的下降。通過健脾止瀉顆粒對脾虛小鼠治療前后的厭氧菌群檢測，發現本方對異常下降的2種厭氧菌均有較明顯的扶植作用。乳桿菌在治療后接近或達到正常水平，而雙歧桿菌則超過了造模前含量。由此可知，健脾止瀉顆粒能通過對異常低下的厭氧菌產生扶植作用，使之與需氧菌的比值達到正常范圍，從而恢復微生態平衡。厭氧菌減少是腸道菌群失調的基本改變之一。健脾止瀉顆粒對雙歧桿菌這一重要的“健康因子”表現出明顯的扶植作用。通過扶植益生菌而間接排斥病原菌或條件致病菌，達到扶正祛邪之功效，是微生態調節劑的基本作用途徑之一。

［1］任光友，張貴林.四君子湯對動物腸菌失調及正常胃腸功能的藥理研究［J］.中成藥，2000，22（7）：504-506.

［2］陳海龍，裴德凱，王冬梅，等.多器官功能不全綜合征時腸道細菌微生態學改變的實驗研究［J］.中國微生態學雜志，1999，11（1）：22-24.

［3］北京師范大學生物系消化生理科研組.中醫脾虛動物模型的造模［J］.中華醫學雜志，1980，60（2）：83-85.

［4］徐世杰，肖誠，等.實驗性脾虛痹證的黏膜免疫學機制研究［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2003，（9）：12.

［5］修宗昌，余紹源，尚文璠，等.脾虛證與酶學相關性研究概述［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2009，（12）：79.

［6］陳小野.實用中醫脾虛證候模型學［M］.北京：北京醫科大學中國協合醫科大學聯合出版社，1993.12-26.

△通訊作者：李麗靜。