連萸降壓膠囊對自發性高血壓大鼠血清蛋白質組學分析

李 宜，胡元會，齊連芬，王師菡，石 潔，褚瑜光

（1.中國中醫科學院 廣安門醫院，北京 100700；

2.中國中醫科學院廣安門醫院 心血管內科，北京 100053；

3.中國中醫科學院廣安門醫院 功能科，北京 100053）

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目前，從蛋白質組學角度對機體生命活動中某一生理或病理過程進行研究已成為熱點。高血壓病屬中醫學“頭痛”、“眩暈”等范疇，中醫藥治療高血壓病有著廣闊的研究前景，不僅能有效降低血壓水平，還極大地改善患者的生存質量，降低患者并發癥的發生。連萸降壓膠囊主要成分是黃連素、吳茱萸次堿，2種成分合用降壓平穩。本實驗采用雙向凝膠電泳分離連萸降壓膠囊干預自發性高血壓大鼠后的血清蛋白質，從蛋白質組學角度探討連萸降壓膠囊的降血壓機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 12周齡SHR（清潔Ⅱ級）20只，雌雄各半，購自北京維通利華試驗動物技術有限公司（動物合格許可編號 SCXK（京）2007-0001）。

1.1.2 主要實驗儀器 Ettan IPG-phor3等電聚焦儀（GE Healhcare，USA）；Ettan DALT3 System垂直電泳（Bio-Rad，USA）；ImageScanner光密度掃描儀（Amersham pharmacia，USA）；UA-16A分光光度計（Shimadzu corporation，Japan）；Imagemaster凝膠圖像分析軟件（Amersham Pharmacia Biotech，USA）；Auto-REFLEXTMⅢ型基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀（Bruker cooperation USA）；Speed Vac真空冷凍干燥離心機（Thermo Savant USA）。

1.1.3 主要藥品 連萸降壓膠囊：黃連素，兗州大禹制藥有限責任公司，批號國藥準字040709；吳茱萸次堿，西安冠宇生物技術有限公司，批號Evo070503。兩藥以3∶1比例加入0.9％生理鹽水配成溶液（黃連素240mg/kg+吳茱萸次堿80mg/kg的配液法：黃連素14.4g+吳茱萸次堿4.8g加入600ml 0.9％生理鹽水中）。

1.1.4 主要試劑 非線性固相pH梯度干膠條（GE Healhcare pH3～10，18cm）、IPG Buffer（pH 3～10）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、二硫蘇糖醇（DTT）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、溴酚藍、過硫酸胺（APS）、甘氨酸、丙烯酰胺、IPG-Buffer、覆蓋液、瓊脂糖、尿素（Urea）、考馬斯亮藍 R-350、標準蛋白標志物購自 A-Pharmacia公司，三氟乙酸（TFA）、N′-甲叉雙丙烯酰胺、CHAPS購自Sigma公司，無水醋酸鈉、無水碳酸鈉、硝酸銀、硫代硫酸鈉、戊二醛、乙醇、冰醋酸、甲醇、乙腈、甘油、甲醛、1mg/ml牛血清白蛋白（BSA）、碳酸氫氨（NH4HCO3）、無水乙醇等均為國產分析純或色譜純。水為MilliQ超純水、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮-胰蛋白酶（TPCK-TryPsin）、三氟乙酸（TFA）、乙睛（ACN）、基質 a-氰基-4-羥基肉桂酸（CCA）等均購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥 選取12周齡的SHR 20只，體質量203g～358g，隨機數法分為模型組，中藥組每組共10只，雌雄各半。模型組：給予0.9％生理鹽水10ml/（kg·d）灌胃，每天1次，連續灌胃4周；中藥組：按黃連素240mg/（kg·d）+吳茱萸次堿80mg/（kg·d）的劑量配制混懸液，以10ml/（kg·d）灌胃，每天1次，連續灌胃4周。

1.2.2 血清的制備 第4周末，所有大鼠經戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于大鼠手術臺上，頸部去毛，碘伏消毒皮膚，剪開頸前部皮膚，分離肌肉，暴露左頸動脈，自頸外動脈抽取動脈血，放入空白試管，混勻低溫離心（3000r/min，4℃），離心機半徑180mm，離心10 min，取上清液，所有樣本均于－86℃低溫冰箱中保存。每組隨機各取5份樣品血清，準備蛋白質組學分析。使用時先離心，轉速為5000r/min，離心5 min，采用 Bradford法測定血清蛋白濃度。

1.2.3 雙向凝膠電泳 模型組、中藥組，每組隨機各取5份樣品進行電泳，第一向按IPGphor等電聚焦系統操作指南進行，電泳參數如下：溫度20℃，最大電流 －50μA，電壓（V）：30～11h；500～1h；1000～1 h；8000～10 h；合計 23h。在 Ettan DALT3 System垂直電泳槽內進行第二向。電泳條件：恒流40mA 40min、60mA 5h，直至溴酚藍前沿到達玻璃板底部停止電泳（約5～7h）。銀染色后獲得凝膠圖譜。

1.2.4 凝膠圖像分析 采用Image Scanner掃描儀進行掃描并獲取圖像。以Imagemaster分析軟件對其進行圖像分析。差異蛋白質點的選擇：有2倍以上差異表達（表達上調或下調）。

1.2.5 差異蛋白質點的質譜分析 凝膠考染后，選取差異蛋白質點進行膠內酶解，經水洗、脫色處理后，獲得蛋白質肽混合樣品。用 Burker公司REFLEXTMⅢ型 MALDI-TOF-MS質譜儀進行分析：線性模式，正離子譜測定，加速電壓20KV，反射電壓為23KV，質譜信號單次掃描累加50次。基質用CCA，以基質峰和胰蛋白酶自動降解離子峰作為內部標準校正，獲得肽質量指紋圖譜（PMF）。

1.2.6 數據庫查詢 獲得的PMF圖譜用Mascot軟件識別單同位素信號峰，獲得肽片段的質荷比（M/Z），Mascot查詢系統（http://www.matrixscience.co.uk）進行檢索。搜索數據庫為NCBI蛋白質數據庫。檢索參數設置為：

Database-NCBInr， Taxonomy-Rattus， Enzyme-Trypsin， Allow up to-1， Variable modifications-Carbamidonethyl（C）和 Oxidation（M），Peptide tol. ±（0.3）。

1.3 統計學方法

所有數據以均數±標準差表示，使用SPSS 11.0統計軟件進行統計分析，2組之間比較采用t檢驗，以P＜0.05為具有統計學意義。

2 結果

2.1 2組大鼠血清蛋白質雙向凝膠電泳（2-DE）圖譜

以18cm非線性IPG膠條對血清蛋白進行2-DE，銀染后圖像分析，蛋白點分布清晰，在相同條件下對模型組、中藥組的血清總蛋白，每組各5份樣品進行雙向電泳，發現5次雙向電泳圖譜非常相似，分別將其中的一塊有大量分辨率高、質量好的蛋白質點膠定為參考膠，進行5塊膠間的蛋白質點的匹配，蛋白點經標準化后輸出數據到 Excel進行統計分析，組內平均匹配率分別76％、74％，樣品重復性好，制備穩定。模型組、中藥組的血清雙向電泳凝膠上的平均蛋白點分別為：476±30、504±45個。組間平均匹配率65％，可用于差異蛋白質點的分析。

2.2 2組差異表達蛋白質點局部圖譜

分析2組圖譜，連萸降壓膠囊干預自發性高血壓大鼠后，有22個蛋白表達發生顯著變化，表達增強的15個，表達降低的4個，新增加蛋白點3個。

2.3 質譜分析及鑒定結果

22個差異蛋白質點中，共鑒定出10個蛋白點，另外的蛋白質點，由于沒有得到令人滿意的肽質量指紋圖譜或搜索數據庫時不能得到可信度較高的結果而未能鑒定。鑒定出的10個蛋白質為視黃醇結合蛋白、E3泛素連接酶、線粒體膜蛋白、鋅指蛋白、T細胞受體、轉甲狀腺蛋白 A-鏈、Rho GTPase、methyltransferase，UbiE/COQ5 family、2 個假想蛋白。

3 討論

高血壓病是臨床常見病、多發病，隨著我國經濟的發展和人民生活水平的提高，高血壓病的發生率較10年前明顯增加［1］且目前沒有一種特效抗高血壓的西藥可以治愈高血壓或完全逆轉或預防與高血壓相關靶器官的病理改變［2］。中醫藥治療高血壓病療效確切，改善癥狀明顯，可以同時兼顧高血壓并發癥和伴隨的其他危險因素的治療。

本實驗以自發性高血壓大鼠為觀察對象，通過蛋白質組學雙向電泳技術研究，連萸降壓膠囊干預后的自發性高血壓大鼠血清蛋白質的不同表達，成功構建2組血清蛋白質雙向凝膠電泳圖譜。雙向凝膠電泳（2-DE）是目前蛋白質組學中用于分離蛋白質最廣泛的一種方法。同時2-DE也存在對大分子、疏水蛋白以及極酸極堿蛋白質較難分離的缺點［3］。

連萸降壓膠囊干預自發性高血壓大鼠后，新出現的蛋白質鑒定為E3泛素連接酶和甲基轉移酶（methyltransferase，UbiE/COQ5 family）。E3泛素連接酶負責確定蛋白質泛素化的特異性，識別靶蛋白底物，在蛋白酶體降解蛋白質的過程中起極其重要的作用［4］。蛋白質的泛素化作為真核生物蛋白質降解的重要機制，對許多重要的生物進程如細胞周期、基因轉錄和細胞信號傳導等是至關重要的［5］。甲基結合生物胺類在體內與甲基結合的反應，也稱甲基化。甲基來自蛋氨酸，蛋氨酸的甲基經ATP活化成為S-腺苷蛋氨酸，再經甲基轉移酶催化，使生物胺類與甲基結合而被解毒排泄，甲基轉移酶屬于催化底物之間進行某些基團的轉移或交換的酶類，酶只對具有特定空間結構的某種底物起作用。Rho家族蛋白與血管狹窄發生過程中血管平滑肌細胞的遷移密切相關。GTPase介導的小分子蛋白和細胞遷移密切相關，阻斷Rho可減少血管平滑肌細胞遷移［6］。血清視黃醇結合蛋白是2005年 YangQ等［7］鑒定出的一種新的脂肪因子，血清視黃醇結合蛋白4（RBP4）水平與血壓呈正相關，既往研究提示，血清RBP4水平與肥胖、胰島素抵抗等的發生有關，而胰島素抵抗與高血壓的發生、發展都有密切的關系。

綜上所述，鑒定出的這些蛋白質與連萸降壓膠囊的降血壓和改善癥狀密切相關，可能是連萸降壓膠囊治療作用的靶點。有關這些顯著變化的蛋白質的性質、功能及相互關系尚待進一步研究。

（致謝：本實驗得到中國軍事醫學科學院生物醫學分析中心的王鴻麗、趙永強、薛艷等老師的大力協助，在此表示衷心的感謝!）

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［3］LOPEZJ L. Two-dimensional electrophoresis in proteome expression analysis［J］.JChromatogr B Analyt Tehnol Biomed Life Sci，2007，849（1-2）：190-202.

［4］Ciechanover A，Orian A，Schwartz A L.The ubiquitin-mediated proteolytic pathway：mode of action and clinical implications［J］.J Cell Biochem，2000，77（S34）：40-51.

［5］Weissman A M.Themes and variations on ubiquitylation［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2001，2（3）：169-178.

［6］Seasholtz TM，Majumdar M，Kaplan D，et al.RHO and RHO kinase mediate thrombin-stimulated VSMC DNA synthesis and gration［J］.Circulation，1999，84：1186-1193.

［7］Yang Q，GrahamTE，ModyN，et al.Serum retinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes［J］.Nature，2005，436：356-362.