大黃魚肌肉生長抑制素基因外顯子Ⅱ遺傳多態(tài)性分析

楊斌，薛良義，葉秀麗，董小敬

（寧波大學生命科學與生物工程學院，浙江 寧波 315211）

大黃魚肌肉生長抑制素基因外顯子Ⅱ遺傳多態(tài)性分析

楊斌，薛良義，葉秀麗，董小敬

（寧波大學生命科學與生物工程學院，浙江 寧波 315211）

肌肉生長抑制素是控制動物骨骼肌生長發(fā)育的重要細胞因子，采用PCR-SSCP和測序方法分析了150尾大黃魚樣本肌肉生長抑制素基因(myostatin）外顯子Ⅱ的單核苷酸多態(tài)性，結果發(fā)現(xiàn)，外顯子Ⅱ中有10個多態(tài)位點，分別是29、131、206、261、231、243、265、273、297和300位。其中131位點T →A突變引起相應的氨基酸由L→Q，265位點T→C突變引起相應氨基酸由C→R，261位點A→G突變引起相應氨基酸由S→G，231位點的T→C突變引起相應氨基酸由W→S，273位點的C→T突變引起相應的氨基酸由R→W,297位點的A→G突變引起相應氨基酸由I→V,243位點的G→A突變引起相應氨基酸由D→N,300位點的G→A突變引起相應氨基酸由E→K。29位點A →G和206位點C→A均屬于同義突變。存在6種基因型，他們的基因頻率分別是0.57、0.23、0.10、0.04、0.02、0.04，該基因位點的雜合度為0.33。

大黃魚；肌肉生長抑制素基因；單鏈構象多態(tài)性；生長性狀

Abstract:Myostatin (MSTN )as an important cytokine controls the growth and development of skeletal muscle in animals.Ten single nucleotide polymorphisms (SNPs)were totally identified in the exon Ⅱof MSTN gene from 150(70 of one –year old and 80 of two-year old)large yellow croakers，Pseudosciaena crocea，individuals by PCR-SSCP and sequencing.The ten polymorphic sites were located at 29(A→G),131(T→A),206(C→A),231(T→C),243(G→A),261(A→G),265(T→C),273(C→T),297(A→G)and 300(G→A).Base mutations at sites 131,265,261,231,273,297,243 and 300 resulted in amino acid substitutions of L→Q,C→R,S→G,W→S,R→W,T→V,D→N and E→K,respectively.However,base mutations at sites 29 and 206 did not cause amino acid substitution.There were six genotypes in the examined population,whose frequency was 0.57、0.23、0.10、0.04、0.02and 0.04,respectively.The heterozygosity of MSTN locus was 0.33.

Keywords:Pseudosciaena crocea; MSTN; SSCP; growth trait

生長分化因子 8（growth and differentiation factor-8，GDF-8）基因最先由MePherron等從小鼠骨骼肌cDNA文庫中篩選得到，因它對小鼠骨骼肌的生長起抑制作用，故又稱為肌肉生長抑制素基因（myostatin，MSTN）[1]。在斑馬魚(Danio rerio)中，通過轉基因和RNAi技術抑制該基因的功能,試驗魚的肌肉明顯較正常魚發(fā)達,證實該基因參與魚類肌肉生長的負調控[2,3]。目前已在斑馬魚（Danio rerio）、溪紅點鮭（Salvelinus fontinalis）、虹鱒魚（Oncorhynchus mykiss）、銀大麻哈魚(Oncorhynchus kisutch）、大麻哈魚（Salmo salar）和金頭鯛（Sparus aurata）等多種魚類中克隆得到了MSTN基因[4-15]。近來研究發(fā)現(xiàn)魚類MSTN基因在結構上與高等脊椎動物有高度的相似性，但在組織表達上存在較大差異。哺乳動物中，MSTN基因除了在小鼠的骨骼肌中表達，在豬的乳腺、牛的蒲肯野氏纖維和心肌細胞中也有一定程度的表達[16,17]。在魚類，MSTN基因除了在骨骼肌中表達，還在眼球、鰓絲、腦、腸、生殖腺、脂肪等組織中表達，表達范圍比哺乳類要廣泛[8,17]。

單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)是生物體基因組中存在最廣泛的一類變異，稱為第3代分子標記，在基因組和基因功能研究中具有重要的作用。單鏈構象多態(tài)性（single-strand conformation polymorphism，SSCP）作為檢測基因多態(tài)性的方法，簡便、快速、靈敏，不但可用于檢測基因點突變和短序列的缺失和插入，而且還被用于DNA定量分析，監(jiān)測PCR診斷實驗中的交叉污染情況。已有研究表明，牛、豬、雞等畜禽MSTN突變等位基因與動物肌肉產量相關，如比利時藍牛的MSTN基因外顯子Ⅲ缺失11bp造成移碼突變，使缺失突變后面的第14位密碼子變?yōu)榻K止密碼子，合成無功能的MSTN蛋白，使其骨骼肌數(shù)量是其他品種的4倍[18,19]。雞MSTN基因外顯子I的兩個點突變，造成Bsh1236I和Msp I酶切位點的消失，導致其胸重肌和胸肌率顯著提高[20]。目前對魚類MSTN基因與生長相關性的報道有本實驗室之前發(fā)表的大黃魚MSTN基因外顯子I遺傳多態(tài)性分析[21]。大黃魚是中國的名貴魚類，也是重要的海水養(yǎng)殖魚類,筆者在克隆大黃魚 MSTN 基因的基礎上，對該基因外顯子Ⅱ的遺傳多態(tài)性及與生長的相關性進行了初步分析，以期為尋找與生長性狀相關的候選標記位點打下基礎[15]。

1 材料和方法

1.1 材 料

150尾大黃魚樣本（其中1齡70尾，2齡80尾）取自浙江象山港同一網箱養(yǎng)殖群體，經測量體質量、體長后，用無菌剪刀取肌肉組織分裝于 1.5ml離心管，并迅速置于液氮罐中帶回實驗室，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用常規(guī)的酚-氯仿法提取。

1.2.2 PCR擴增 根據(jù)本實驗室克隆的大黃魚MSTN 基因序列(GenBank AY842934)，使用Primer 5.0軟件設計出一對擴增引物 W2F:5’-AGCCGAGTCCGTCGTCCAAG-3’和 W2R: 5’-ATAAAGGTTCAGCTCACCAGTCC-3’，由上海英駿生物技術有限公司合成。預期擴增目的片段為MSTN 基因的外顯子Ⅱ，長度為371bp。

PCR 反應體系: 10×PCR buffer 2.5 μl，25 mmol/L MgCl21.5 μl，dNTP(每種 10 mmol/L)0.5μl，引物(每種 20 μmol/L)各 0.5μl，TaqDNA 聚合酶 1U，模板DNA 50 ng，反應總體積為25 μl。反應條件:94 ℃預變性3 min，30個循環(huán)(94 ℃，30 s；54.5℃，30 s；72 ℃，30 s)，72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。

1.2.3 單鏈構象多態(tài)性分析 取PCR產物10 μl放入滅菌的小離心管中，加入 2μl變性上樣緩沖液(95%甲酰胺、0.05%溴酚藍、20 mmol/L EDTA)；98 ℃水浴變性10 min，冰浴5 min；12%非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acro /Bis為29:1)電泳8～9 h(10 V/cm)；0.2%硝酸銀染色。

1.2.4 克隆和測序 對具單鏈構象多態(tài)性的PCR擴增片段用PCR產物純化試劑盒(上海生工)進行純化,步驟參照其說明書。純化產物的連接采用PMD18–T Vector試劑盒(大連寶生物公司)，轉化菌株為DH5α。陽性克隆經PCR法鑒定后，送上海生物工程有限公司測序。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 基因頻率按公式Pi=[2(ii)+(ij1)+(ij2)+…+(ijn)]/2N計算，Pi為第i個等位基因的頻率，i為純合復等位基因，j1，j2…jn分別為與i共顯的第1至n個等位基因。基因型頻率的計算方法為:基因型頻率=基因型個體數(shù)/測定群體總數(shù)。群體雜合度(Heterozygosity)根據(jù)Nei公式計算:

式中：h為群體內該基因位點的雜合度，為該位點所具有的等位基因數(shù)，Pi為該位點上第i個等位基因頻率。

多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）按照Botstein等。（1980）公式計算：

式中Pi、Pj分別為種群中第i、j個等位基因頻率，n為等位基因數(shù)。

利用 SPSS 軟件包中的 GLM (General linear model )分析不同基因型對大黃魚體質量和體長的影響。

2 結果與分析

2.1 目的片段PCR擴增

經PCR擴增的目的片段如圖1，與預期擴增長度相符，且條帶亮度較好，沒有非特異性條帶，可用于SSCP分析。

2.2 SSCP分析

將PCR產物進行SSCP分析，并經測序驗證，結果表現(xiàn)出6種基因型，其中兩條帶型的有兩種，分別命名為AA，CC型；3條帶型的有3種，分別命名為 AB，AC，AD，4條帶型的有 1種，命名為AE。

圖1 大黃魚MSTN基因外顯子ⅡPCR擴增電泳圖Fig.1 Electrophotogram of PCR product of Exon Ⅱof MSTN in the large yellow croaker

圖2 150尾大黃魚MSTN基因外顯子Ⅱ聚丙烯酰胺凝膠電泳帶型示意圖Fig.2 Schematic diagram above shows results of PCR-SSCP on MSTN Exon Ⅱ of 150 large yellow croakers

2.3 MSTN基因不同基因型外顯子Ⅱ的序列測定

對不同基因型的PCR產物進行純化回收測序，并與GeneBank中登錄的序列（AY842934）進行比對，發(fā)現(xiàn)AA型與AY842934序列一致，其他基因型均存在不同程度的單核苷酸突變。在外顯子II中有 10 個突變位點，分別是 29（A →G）、131（T→A）、206（C→A）、261（A→G）、243（G→A）、300（G→A）、265（T→C）、231（T→C）、273（C→T）、297（A→G）。其中 131位點 T →A突變引起相應的氨基酸由L→Q，265位點T→C突變引起相應氨基酸由C→R，261位點A→G突變引起相應氨基酸由S→G，231位點的T→C突變引起相應氨基酸由W→S，273位點的C→T突變引起相應的氨基酸由R→W，297位點的A→G突變引起相應氨基酸由I→V，243位點的G→A突變引起相應氨基酸由D→N，300位點的G→A突變引起相應氨基酸由E→K。29位點A →G和206位點C→A均屬于同義突變，未引起氨基酸的變化（表1）。AB型和AC型外顯子Ⅱ部分序列見圖4。

運用EBI網站里的Transeq工具，將不同基因型的大黃魚MSTN基因外顯子Ⅱ序列翻譯為氨基酸序列，分析不同基因型大黃魚MSTN基因外顯子Ⅱ序列堿基突變引起的相應氨基酸序列變化（圖5）。

2.4 外顯子Ⅱ的基因型及基因頻率

在150尾大黃魚肌肉樣本中AA型個體最多有85尾，其次是AB型，共有34尾，突變基因型AE個體最少只有3尾。AA、AB、AC、AD、AE、CC這6種基因型的基因頻率分別為0.57、0.23、0.10、0.04、0.02、0.04。等位基因A、B、C、D、E的頻率分別為0.763、0113、0.09、0.024、0.01。經過計算，150尾大黃魚肌肉樣本的基因的雜合度為0.33，多態(tài)信息含量PIC=0.37。

圖3 大黃魚MSTN基因外顯子Ⅱ測序圖（A圖為AB型外顯子Ⅱ序列，突變發(fā)生在外顯子Ⅱ29位A→G，B圖為AC型外顯子Ⅱ序列，突變發(fā)生在外顯子Ⅱ131位T→A）Fig.3 Sequence analysis of MSTN gene Exon Ⅱ of the large yellow croaker

圖4 大黃魚MSTN基因外顯子Ⅱ不同基因型序列編碼的氨基酸序列Fig.4 Sequences of Amino acid translated from MSTN gene Exon Ⅱof the large yellow croaker with different genetypes

3 討 論

近年來國內外的很多研究都證明了MSTN基因具有突變和多態(tài)性并影響到了生物的生長發(fā)育等性狀，如McPherron等發(fā)現(xiàn)比利時藍牛中MSTN基因缺失11 bp，導致該基因閱讀框架發(fā)生改變，分子活性區(qū)域消失，出現(xiàn)肌肉特別發(fā)達的雙肌牛，皮埃蒙特牛的MSTN基因外顯子I中C突變成A，外顯示子3中G突變成A，從而導致雙肌牛[22]。在人類中也發(fā)現(xiàn)了一個MSTN基因的天然突變，外顯子I的G→A 突變，導致108 bp長度的mRNA被錯誤剪輯，使MSTN基因編碼的蛋白質長度減少，喪失其功能，其表型與MSTN基因敲除小鼠的表型類似，骨骼肌比正常人要發(fā)達。國內對雞(Gallus gallus)、豬(Sus scrofa)、綿羊(Ovis aries)等的研究也表明MSTN 存在多態(tài)性[20,23-26]。在本研究中，大黃魚MSTN基因外顯子Ⅱ存在多處單堿基突變，除了同義突變外，還有導致氨基酸水平上發(fā)生改變的錯義突變，如L→Q，C→R，S→G，W→S，R→W，I→V，D→N和E→K，使得大黃魚MSTN基因外顯子Ⅱ的PCR-SSCP結果較為復雜。

群體的雜合度是表示在被檢測的位點上群體中的雜合子頻率，群體平均雜合度的高低反應了群體的遺傳一致性程度，平均雜合度越高，群體的遺傳一致性就越低，其遺傳多樣性越高。本試驗中的大黃魚MSTN基因外顯子Ⅱ雜合度h為0.33，遠低于大黃魚MSTN基因3’-UTR區(qū)內（CA）n微衛(wèi)星序列微衛(wèi)星序列[28]的雜合度（0.93），也低于大黃魚MSTN 基因外顯子Ⅰ[21]的雜合度（0.709）。顯示該群體中MSTN基因外顯子Ⅱ的一致性較高，表明大黃魚MSTN基因外顯子Ⅱ在遺傳過程中較上述兩個序列更為保守。據(jù)單淇[32]報道，長江流域瑞昌、寧河和長沙3地鳙魚mtDNA D-loop區(qū)段限制性片段的雜合度分別為0.6883、0.4459和0.2379。由于基因、基因互作和基因組背景效應的復雜性，群體雜合度和性狀之間不是簡單的相關關系,因此有必要進一步研究大黃魚MSTN基因各外顯子群體雜合度和生長性狀的關系[29,30]。

多態(tài)信息含量是基因多態(tài)信息高低的一個指標，當 PIC＞0.5時，該基因座為高度多態(tài)基因座，標記可提供信息較多，當0.25＜PIC＜0.5時，為中度多態(tài)基因座，標記提供的信息較合理；當 PIC＜0.25時，為低度多態(tài)基因座，標記提供的信息較差[27]。本文分析中的大黃魚MSTN基因外顯子Ⅱ的PIC為0.37，屬于中度多態(tài)基因座位，較之前本實驗室研究的大黃魚MSTN基因3’-UTR區(qū)內（CA）n微衛(wèi)星序列，以及大黃魚MSTN基因外顯子I序列的多態(tài)信息含量要低，這與群體雜合度的結果一致[21,28]。在哺乳動物中，東北馬鹿的MSTN基因多態(tài)信息含量為0.17，說明該基因在高等動物中可能更加保守[31]。

MSTN基因多態(tài)性與相關性狀間的關系，近年來在家禽畜中已有較多的報道,如李紹華等的研究表明，大白豬(Sus scrofa)MSTN基因的外顯子Ⅱ有3種基因型，外顯子Ⅲ有2種基因型，外顯子Ⅱ的多態(tài)性與生產性狀不相關，而外顯子Ⅲ的多態(tài)性與豬的背膘厚呈顯著性相關[25]。在的大黃魚MSTN基因的研究中，外顯子Ⅰ的多態(tài)性與與大黃魚體重、體長呈顯著性相關[21]，這些結果表明MSTN基因不同的外顯子多態(tài)性對動物的生長性狀具有不同的影響。在本研究中，僅對1齡和2齡大黃魚MSTN基因外顯子Ⅱ的單核苷酸多態(tài)性進行了分析，并將以此為基點探討分析大黃魚MSTN基因外顯子Ⅱ與生長性狀的關系。

致謝：寧波大學生命科學院薛良義教授對本文寫作進行了指導和幫助，實驗室成員黃偉、李婷、董海陽、劉曉飛等參加象山養(yǎng)殖場取樣工作，在此一并致謝。

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Gentic polymorphism analysis of exon Ⅱ in MSTN gene from large yellow croaker,Pseudosciaena crocea

YANG Bin,XUE Liang-yi,YE Xiu-li,DONG Xiao-jing
(College of Life Science and Biotechnology,Ningbo University,Ningbo 315211,China)

Q959.483; Q31

A

1001-6932(2010)05-0554-06

2009-10-12；

2009-12-28

國家863項目（2006AA10A405）和國家自然科學基金（30871916）

楊斌（1982－），男，浙江人，碩士。研究方向：海洋生物基因資源，電子郵箱：bluestar180@sina.com

薛良義，教授，從事水產生物技術研究。電子郵箱：xueliangyi@nbu.edu.cn