鹽酸伐昔洛韋片的人體藥動(dòng)學(xué)及生物等效性研究

趙，洪 博，隋欣蕙，趙春杰（沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽(yáng)市110016）

鹽酸伐昔洛韋（Valaciclovir hydrochloride）是阿昔洛韋的前體藥物，口服后迅速吸收轉(zhuǎn)化為阿昔洛韋。其抗病毒作用為阿昔洛韋所發(fā)揮，阿昔洛韋進(jìn)入皰疹感染細(xì)胞之后，與脫氧核苷競(jìng)爭(zhēng)病毒胸腺嘧啶激酶或細(xì)胞激酶，藥物被磷酸化成活化型無(wú)環(huán)鳥苷三磷酸酯，作為病毒復(fù)制的底物與脫氧鳥嘌呤三磷酸酯競(jìng)爭(zhēng)病毒脫氧核糖核酸（DNA）多聚酶，從而抑制了病毒DNA合成，顯示抗病毒作用。本品體內(nèi)的抗病毒活性優(yōu)于阿昔洛韋，對(duì)單純性皰疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型的治療指數(shù)分別比阿昔洛韋高42.91%和30.13%。本研究參考有關(guān)鹽酸伐昔洛韋制劑的相對(duì)生物利用度及其生物等效性評(píng)價(jià)，采用高效液相色譜法，測(cè)定了健康人口服2種鹽酸伐昔洛韋片后經(jīng)時(shí)過程的血藥濃度，并計(jì)算出血藥濃度-時(shí)間曲線下面積（AUC0～14、AUC0～∞）、相對(duì)生物利用度等有關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，進(jìn)行生物等效性評(píng)價(jià)，為臨床合理用藥及對(duì)鹽酸伐昔洛韋進(jìn)一步開發(fā)研究提供數(shù)據(jù)依據(jù)及一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀，包括LC-10AT泵、SPD-10A型紫外檢測(cè)器（190～600 nm）、SiL-10A全自動(dòng)進(jìn)樣器（日本島津公司）；NC-2000型色譜工作站（大連中北科學(xué)技術(shù)公司）；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；TG332A型微量分析天平（上海分析天平廠）；AS-3120超聲波清洗儀（浙江石浦海天電子儀器廠）；YKH-Ⅱ型液體快速混合器（江西醫(yī)療器械廠）。

1.2 試藥

阿昔洛韋對(duì)照品（成都倍特藥業(yè)有限公司）；受試制劑：鹽酸伐昔洛韋片（成都倍特藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：每片0.3 g）；參比制劑：鹽酸伐昔洛韋片（四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，規(guī)格：每片0.3 g）；甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純，水為三重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 受試者的選擇

18名男性健康志愿者，均為在校大學(xué)生，年齡（21～23）歲，體質(zhì)量（66.2～76.6）kg，身高（171.9～182.1）cm。受試前進(jìn)行血、尿常規(guī)及肝、腎功能等檢查，確證為健康者后方可進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)前2周至試驗(yàn)期間不服用其它任何藥物，試驗(yàn)期間禁煙、酒及含咖啡因的飲料，受試者均簽署知情同意書，志愿作為受試者參加鹽酸伐昔洛韋片的相對(duì)生物利用度試驗(yàn)，試驗(yàn)經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

2.2 試驗(yàn)方案

采用單劑量雙周期交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)。18名志愿者隨機(jī)分為2組，受試者服藥前1天晚上進(jìn)食清淡，受試當(dāng)天早晨空腹，服藥前定時(shí)記錄心電圖，藥物以200 mL溫開水送服（頓服），服藥后受試者被安排在醫(yī)院的觀察室休息，采血期間不得離開，避免劇烈運(yùn)動(dòng)。各種急救藥品齊全，設(shè)施運(yùn)轉(zhuǎn)正常，能自始至終保證受試者安全。2組分別于清晨7∶00空腹服用受試制劑與參比制劑2片（各含鹽酸伐昔洛韋600 mg），服藥后4 h統(tǒng)一進(jìn)低脂肪標(biāo)準(zhǔn)餐，1周后交叉服藥。用藥期間和用藥后，受試者均未出現(xiàn)任何明顯不良反應(yīng)。受試制劑組與參比制劑組分別于服藥前0 h和服藥后0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、11.0、14.0 h時(shí)采肘靜脈血5.0 mL。所采血樣置于含肝素抗凝劑的離心試管中，4 000 r·min－1離心3 min，分離血漿，于－20℃保存待測(cè)。

2.3 血漿樣品處理

精密吸取血漿樣品1.0 mL，置于具塞離心管中，加6%高氯酸0.5 mL，渦旋振蕩1.5 min，4 000 r·min－1離心10 min，取上清液，20μL進(jìn)樣分析。

2.4 色譜條件

色譜柱：Kromail C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.05 mol·L－1醋酸銨（pH＝4.0）-甲醇（94∶6）；流速：1.0 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；檢測(cè)器靈敏度：0.01 AUFS；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.5 專屬性考察

血漿樣品按本法分離測(cè)定所得色譜圖表明，空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)無(wú)干擾，通過與空白血漿添加對(duì)照品色譜圖比較，確證9.929 min色譜峰為阿昔洛韋色譜峰。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取空白血漿1.0 mL，分別加入不同濃度的阿昔洛韋對(duì)照溶液 100 μL，使血漿濃度分別為 0.102、0.357、0.510、1.122、4.080、5.100 μg·mL－1，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。以阿昔洛韋峰面積（A）為縱坐標(biāo)，阿昔洛韋的濃度（C）為橫坐標(biāo)，按加權(quán)最小二乘法（權(quán)重1/C2×105）進(jìn)行回歸，得回歸方程為：A＝48.24×103C+6.924×103（r＝0.997 0）。結(jié)果表明，阿昔洛韋血藥濃度在0.102～5.100 μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。定量下限為0.102 μg·mL－1。

2.7 回收率及精密度試驗(yàn)

分別配制0.102、1.122、4.080 μg·mL－13種濃度的阿昔洛韋模擬血漿樣品5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜并計(jì)算回收率；另分別于同日內(nèi)和1周內(nèi)測(cè)定5次，求得日內(nèi)和日間精密度。精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab 1 Results of precision and recovery test（n＝5）

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

配制1.122 μg·mL－1的模擬血漿樣品分別進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性、室溫穩(wěn)定性試驗(yàn)：（1）長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)：血漿樣品在－20℃低溫冷凍0、7、14、21、30 d后處理分析，測(cè)得結(jié)果為1.117 μg·mL－1，RSD＝4.79%；（2）凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)：血漿樣品在－20℃冷凍24 h，取出完全融解（反復(fù)凍融3次），按“2.3”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣分析，測(cè)得結(jié)果為1.120 μg·mL－1，RSD＝4.22%；（3）室溫穩(wěn)定性試驗(yàn)：血漿樣品在室溫條件下放置 0、1、2、4、8 h后處理分析，測(cè)得結(jié)果為1.106 μg·mL－1，RSD＝5.40%

2.9 藥-時(shí)曲線

未知血漿樣品測(cè)定按“2.3”項(xiàng)下方法操作處理，用當(dāng)天批次的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)樣品中阿昔洛韋的血藥濃度。18名健康志愿受試者口服2種鹽酸伐昔洛韋片600 mg后平均藥-時(shí)曲線見圖2。

圖2 受試者口服2種鹽酸伐昔洛韋片600 mg后平均藥-時(shí)曲線Fig 2 Mean plasma concentration-time curve of of the test or reference formulations after oral administration of 600 mg dose

2.10 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

18名受試者藥-時(shí)數(shù)據(jù)分別進(jìn)行有關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算，以梯形法求算AUC，根據(jù)對(duì)數(shù)藥-時(shí)曲線末端直線部分的斜率求算消除半衰期（t1/2），峰濃度（Cmax）和達(dá)峰時(shí)間（tmax）用實(shí)測(cè)值表示。采用交叉設(shè)計(jì)方差分析法，對(duì)受試制劑和參比制劑的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行方差分析。用雙單側(cè)檢驗(yàn)法（two one-side test）和（1－2α）置信區(qū)間法進(jìn)行生物等效性評(píng)價(jià)，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表2。

表2 受試者口服2種鹽酸伐昔洛韋片600 mg后平均藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tab 2 Pharmacokinetic parameters of the test or reference formulations after oral administration of 600 mg dose

2.11 生物等效性評(píng)價(jià)

采用交叉設(shè)計(jì)方差分析法對(duì)2種制劑的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明2種制劑的Cmax、tmax、AUC0～14、AUC0～∞劑型間、個(gè)體間和周期間均無(wú)顯著性差異，與文獻(xiàn)報(bào)道[1，2]的鹽酸伐昔洛韋片的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)一致。雙單側(cè)檢驗(yàn)法（two one-side test）和（1－2α）置信區(qū)間法計(jì)算結(jié)果表明，2種制劑的單劑量交叉口服給藥的Cmax、tmax、AUC0～14、AUC0～∞的t1、t2值均大于t（1－0.05），且受試制劑參數(shù)AUC0～14、AUC0～∞的90%可信限落在參比制劑80%～125%范圍內(nèi)，Cmax落在70%～143%范圍內(nèi)。受試制劑相對(duì)于參比制劑的生物利用度為（101.06±11.72）%。因此，2種制劑具有生物等效性。

3 討論

曾有文獻(xiàn)報(bào)道采用高效液相色譜熒光法[3]、液-質(zhì)聯(lián)用法[4]、高效毛細(xì)管電泳法等[5]測(cè)定阿昔洛韋的含量，但是上述方法對(duì)試驗(yàn)儀器要求較高，不便于推廣。本文建立了一種實(shí)用范圍更廣的高效液相色譜-紫外檢測(cè)法，方法簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

樣品預(yù)處理中，綜合文獻(xiàn)[6]方法考慮，Kishino等[7]采用固相萃取的處理方法，操作過于煩瑣，且試驗(yàn)成本較高；Bahrami等[8]采用液-液萃取的方法，依然很復(fù)雜。因阿昔洛韋的水溶性較差，較偏堿性，所以本試驗(yàn)采用高氯酸法去蛋白，既可有效去除內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，又可將阿昔洛韋更完全地提取出來(lái)，方法簡(jiǎn)便、快捷，符合大批量生物樣品的分析要求。

流動(dòng)相考察中，筆者最終選擇加入0.05 mol·L－1醋酸銨后調(diào)pH值約為4.0時(shí)，基線平穩(wěn)，能將阿昔洛韋峰和其它干擾峰完全分開，且峰形較好。

[1]董亞琳，王茂義，尤海生，等.鹽酸伐昔洛韋片的藥動(dòng)學(xué)及相對(duì)生物利用度[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007，27（9）：1 214.

[2]陳束葉，李銅鈴，張 潔，等.鹽酸伐昔洛韋片的人體生物等效性[J].中國(guó)臨床藥學(xué)雜志，2007，16（2）：94.

[3]施孝金，張莉莉，李 東，等.鹽酸萬(wàn)乃洛韋人血漿濃度的HPLC-熒光法測(cè)定及其藥動(dòng)學(xué)[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2002，33（3）：128.

[4]卞曉潔，勉強(qiáng)輝，丁 黎，等.人血漿中阿昔洛韋的HPLCMS法的建立及鹽酸伐昔洛韋片的生物等效性研究[J].藥學(xué)與臨床研究，2005，15（1）：28.

[5]梁改玲，連 瑩.高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定鹽酸伐昔洛韋含量及有關(guān)物質(zhì)[J].藥物分析雜志，2007，27（4）：599.

[6]張 潔，李銅鈴，孫 建，等.鹽酸伐昔洛韋泡騰片在人體內(nèi)的生物等效性[J].華西藥學(xué)雜志，2006，21（6）：544.

[7]Kishino S，Takekuma Y，Sugawara M，et al.Liquid chromatographic method for the determination of ganc iclovir and/or acyclovir in human plasma using pulsed amperometric detection[J].J Chromatogr B Analyt Technol Bionmed Life Sci，2002，780（2）：289.

[8]Bahrami G，Mirzaeei1 S，Kiani A.Determination of acyclovir in human serum by high-performance liquid chromatography using liquid-liquid extraction and its application in pharmacokinetic studies[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2005，816（1）：327.