正交試驗(yàn)法優(yōu)選葛連口服液的提取工藝*

楊 波，陳淑映，蔡麗云，劉東文

（廣東省佛山市中醫(yī)院，廣東 佛山 528000）

正交試驗(yàn)法優(yōu)選葛連口服液的提取工藝*

楊 波，陳淑映，蔡麗云，劉東文

（廣東省佛山市中醫(yī)院，廣東 佛山 528000）

目的 優(yōu)選葛連口服液的最佳提取工藝。方法 以君藥葛根中葛根素和臣藥黃連中鹽酸小檗堿含量為考察指標(biāo)，用正交試驗(yàn)法優(yōu)選水提工藝的加水量、提取時(shí)間和精制方法。結(jié)果 確定的最佳水提條件為用9倍量水煎煮2次，每次1 h，藥液加3%的硅藻土作為沉淀劑。結(jié)論 正交試驗(yàn)優(yōu)選出的葛連口服液提取工藝簡(jiǎn)便、合理，適合于工業(yè)生產(chǎn)。

葛連口服液；高效液相色譜法；正交試驗(yàn)；葛根素；鹽酸小檗堿

Abstract：Objective To optimize the extraction technology of Gelian Oral Liquid.Methods Based on the content of puerarin in Pueraria lobata and the content of berberine hydrochloride in Rhizoma Coptidis，the amount of water，extracting time and refining method were optimized by the orthogonal test.Results The optimum condition of Gelian Oral Liquid for water extraction were 9 times amount of water，decocting twice for 1 h each time，with 3% diatomaceous earth as preciptant.Conclusion The extraction technology optimized by the orthogonal test is simple and reasonable.The optimum condition is available for industrial production.

Key words：Gelian Oral Liquid；HPLC；orthogonal test；puerarin；berberine hydrochloride

葛連顆粒是佛山市中醫(yī)院內(nèi)科驗(yàn)方，由葛根、黃連、白頭翁、木香等藥材組成，具有清熱利濕功效，經(jīng)多年臨床驗(yàn)證，對(duì)各種急性、慢性腸炎，泄瀉腹痛等有很好的療效，但也存在口感差、制備工序收率低的缺點(diǎn)，故擬將顆粒劑改劑型為口服液。筆者以制劑中葛根素、鹽酸小檗堿的含量為考察指標(biāo)，通過(guò)L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)選葛連口服液的提取工藝，報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀，包括Waters-1525型泵，717進(jìn)樣閥，2996紫外檢測(cè)器，800工作站；QG45型管式離心機(jī)（上海離心機(jī)械研究所有限公司）。葛根素對(duì)照品、鹽酸小檗堿對(duì)照品均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；所用藥材均為市售品，經(jīng)鑒定均為正品；硅藻土；甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)影響葛連口服液制備工藝的3個(gè)主要因素，即回流時(shí)間（因素A）、水用量（因素B）、精制方法（因素C），分別設(shè)定3個(gè)水平，因素水平見(jiàn)表1。以成品中葛根素、鹽酸小檗堿含量為考察指標(biāo)，用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定其含量，按正交表L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)考察因素綜合評(píng)分，確定最佳的提取精制工藝。

表1 試驗(yàn)因素水平表

2.2 供試品制備

按處方各藥材比例，取處方藥材9份，分別按正交表L9（34）進(jìn)行試驗(yàn)，提取次數(shù)為2次，水提液濃縮至相對(duì)密度為1.1～1.15（60～80℃）時(shí)再精制。其中醇沉法+超濾法為加入等量95%乙醇至含醇量為47.5%，靜置24 h，取上清液，以慢速濾紙加0.45!m微孔濾膜減壓過(guò)濾；高速離心法為藥液用紗布過(guò)濾后再以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速高速離心處理；吸附澄清法+超濾法為藥液加入3%的硅藻土后靜置24 h，取上清液，用慢速濾紙加0.45!m微孔濾膜減壓過(guò)濾。最后9個(gè)樣品全部定容至1 000 mL，得9份供試品。

2.3 鹽酸小檗堿含量測(cè)定[1]

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Alltima C18柱(250 mm×4.6 mm，5!m)；流動(dòng)相：乙酸乙酯 -甲酸 -乙醇（15∶3∶2）；檢測(cè)波長(zhǎng)：346nm；流速：1.5 mL/min；柱溫：28 ℃ ；進(jìn)樣量：20!L。在此條件下的色譜圖見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.3.2 溶液制備

精密稱(chēng)取鹽酸小檗堿對(duì)照品25.00 mg，置25 mL量瓶中，用鹽酸-50%乙醇(1∶100)溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻后作為對(duì)照品溶液。精密吸取按各精制工藝制備的濃縮液5 mL，置50 mL量瓶中，加鹽酸-50%乙醇(1∶100)溶液至刻度，搖勻，常壓過(guò)濾，取續(xù)濾液，用0.45!m微孔濾膜過(guò)濾，得供試品溶液。取不含黃連的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液(1.00 g/L)0.5，1.0，2.0，4.0，6.0 mL，分別置 10 mL 量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，用0.45!m微孔濾膜過(guò)濾，分別吸取各對(duì)照品溶液20!L進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=64 736 918 X+6 685 231，r=0.999 6（n=5）。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿進(jìn)樣量在0.05～0.6 g/L范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

圖1 鹽酸小檗堿含量測(cè)定高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn)：取同一鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，依法重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果峰面積積分值的 RSD=0.93%（n=5），表明儀器精密度較好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于 0，2，4，6，8 h時(shí)依法測(cè)定。結(jié)果峰面積積分值的 RSD=0.74%（n=5)，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

重現(xiàn)性試驗(yàn)：取用最佳提取工藝制備的樣品，依法制備供試品溶液并進(jìn)樣分析。結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積的 RSD為1.1%（n=5），表明方法重現(xiàn)性較好。

加樣回收試驗(yàn)：精密吸取5 mL已知含量的樣品，置25 mL量瓶中，加適量鹽酸小檗堿對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制備溶液并依法測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.3.4 樣品含量測(cè)定

取樣品，依法制備供試品溶液，吸取20$L注入液相色譜儀，測(cè)定并計(jì)算鹽酸小檗堿含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4 葛根素含量測(cè)定[1-2]

2.4.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Alltima C18柱 (250 mm×4.6 mm，5$m)；流動(dòng)相：甲醇 -水（25 ∶75）；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：28 ℃ ；進(jìn)樣量：20$L。在此條件下的色譜圖見(jiàn)圖2，可見(jiàn)陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.4.2 溶液制備

精密稱(chēng)取葛根素對(duì)照品2.30 mg，置25 mL量瓶中，用30%的乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后作為對(duì)照品溶液。精密吸取按各精制工藝制備的濃縮液5 mL，置25 mL量瓶中，用30%的乙醇定容至刻度，搖勻，以0.45$m微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取不含葛根的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照品溶液。

“數(shù)學(xué)教育中的歷史與認(rèn)識(shí)論歐洲暑期大學(xué)”中的“認(rèn)識(shí)論”主要是指（2）中的“歷史認(rèn)識(shí)論”，尤其強(qiáng)調(diào)數(shù)學(xué)知識(shí)建構(gòu)中的問(wèn)題、錯(cuò)誤、猜想及“認(rèn)識(shí)論斷裂”這個(gè)概念的作用．

2.4.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取對(duì)照品溶液(0.092 g/L)2，4，6，8，10$L，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以峰面積積分值 Y對(duì)對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度 X進(jìn)行回歸分析，得回歸方程 Y=4 052 382 X-87 617，r=0.999 8（ n=5）。結(jié) 果表明，葛根素質(zhì)量濃度在0.184～0.920 g/L范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取同一葛根素對(duì)照品溶液，依法重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果峰面積積分值的 RSD=1.02%（n=5），表明儀器精密度較好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別在 0，3，6，9，12 h 時(shí)依法測(cè)定。結(jié)果峰面積積分值的 RSD=0.89%（n=5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

重現(xiàn)性試驗(yàn)：取同一樣品，依法制備供試品溶液并測(cè)定。結(jié)果葛根素峰面積的 RSD=1.2%(n=5)，表明方法重現(xiàn)性較好。

加樣回收試驗(yàn)：精密吸取5 mL已知含量的樣品，置25 mL量瓶中，加適量葛根素對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制備溶液并依法測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

取樣品適量，依法制備供試品溶液，吸取20$L，注入液相色譜儀，測(cè)定并計(jì)算葛根素含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 正交試驗(yàn)及結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表2和表3。由表2綜合評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)的極差大小可看出，各因素作用的大小依次為C＞B＞A。表3結(jié)果表明，因素C(精制方法)對(duì)提取效果的影響有顯著性(P＜0.05)，因素A（回流時(shí)間）、因素B（水用量）的影響則無(wú)顯著性。綜合直觀分析與方差分析的結(jié)果，同時(shí)考慮生產(chǎn)的可操作性和節(jié)能狀況，確定最佳工藝組合為A1B2C3，即加9倍量的水提取2次，每次1 h，合并提取液，濃縮至相對(duì)密度為1.10～1.15（60～80℃）時(shí)，藥液加入3%的硅藻土，靜置24 h，取上清液，用慢速濾紙加0.45$m微孔濾膜減壓過(guò)濾，濾液定容至1 000 mL。

圖2 葛根素含量測(cè)定高效液相色譜圖

表3 方差分析

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證優(yōu)選工藝的可靠性和重復(fù)性，按最佳工藝平行制備了3份樣品，測(cè)得鹽酸小檗堿的平均含量為0.527 g/L，葛根素的平均含量為0.813 g/L，均高于正交試驗(yàn)9份樣品的含量，說(shuō)明本工藝可靠，適用于工業(yè)生產(chǎn)。

3 討論

多指標(biāo)優(yōu)選中藥復(fù)方提取工藝是提高中藥復(fù)方制劑質(zhì)量的一種重要方法，但要得出一個(gè)合理的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，就必須針對(duì)指標(biāo)間的重要性差異給出權(quán)重，綜合評(píng)分后再進(jìn)行分析。對(duì)各指標(biāo)權(quán)重的設(shè)置，要根據(jù)具體情況作具體分析。本處方中的葛根既能清透邪熱，又能升發(fā)清陽(yáng)，鼓舞脾胃清陽(yáng)之氣上升而奏止瀉止痢之效，屬君藥；黃連用于胃腸濕熱、瀉痢身熱者，為臣藥。因此，葛根素、鹽酸小檗堿含量的權(quán)重系數(shù)分別設(shè)為0.5和0.3。采用綜合評(píng)分的方差分析優(yōu)選出的提取工藝更具科學(xué)性和合理性，對(duì)生產(chǎn)有積極的指導(dǎo)意義。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：213-214，233-234.

[2]唐麗琴，劉 圣，陳禮明，等.高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方黃連顆粒中葛根素的含量[J]. 中國(guó)藥房，2003，14（7）：425-427.

Study on Extraction Technology of Gelian Oral Liquid with Orthogonal Test

Yang Bo，Chen Shuying，Cai Liyun，Liu Dongwen
(Foshan Hospital of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)oshan，Guangdong，China 528000)

TQ461；R286.0

A

1006－4931(2010）11－0032－03

楊波，男，大學(xué)本科，副主任藥師，研究方向?yàn)橹兴幹苿?，（電話?757-82121101（電子信箱）mooneyes73@163.com。

2009－04－23；二次

2009－10－15）

*廣東省佛山市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研立項(xiàng)項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：2007102。