VEGF-C mRNA和EGFR mRNA在非小細胞肺癌腫瘤組織和淋巴結組織中的表達及臨床意義

管燕 郭其森 曾洪生

肺癌已成為我國惡性腫瘤死亡率之首，其中占肺癌80%的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是導致肺癌高發病率和高死亡率的主要原因。血管內皮生長因子C（vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C）是一種針對淋巴管內皮細胞的有絲分裂原，具有刺激血管和淋巴管生成的雙重作用，其表達與腫瘤的血管生成、臨床病理特征和不良預后有關[1]。表皮生長因子受體 ( epidermal growth factor receptor, EGFR）是原癌基因CerbB-1的表達產物，與腫瘤的發生、發展密切相關。近年來對EGFR與腫瘤的血管生成、高侵襲性及轉移關系的研究越來越多，很多研究[2,3]提示EGFR的高表達往往反映腫瘤的高侵襲力、高轉移性及預后不良。本實驗利用RT-PCR與熒光定量PCR技術檢測NSCLC患者和良性肺病患者的腫瘤組織及淋巴結組織中VEGF-C mRNA和EGFR mRNA的表達水平并分析其相關性，以探討兩因子表達水平與臨床病理因素之間的相關性及其與淋巴結轉移的關系。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 總RNA抽提試劑盒購自Invitrogen公司，反轉錄試劑盒購自TaKaRa公司，電泳系統購自BIO-RAD公司，熒光定量基因擴增儀7000型購自美國ABI公司。逆轉錄引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，VEGF-C基因：Forward primer：5'-TCAAGGACAGAAGAGACTATAAAATTTGC-3'；Reverse primer：5'-ACTCCAAACTCCヰCCCCACAT-3'。EGFR基因：Forward primer：5'-GGACTCTGGATCCCAGAAGGTG-3'；Reverse primer：5'-GCTGGCCATCACGTAGGCTT-3'。GAPDH基因：Forward primer：5'- CAACAGCCTCAAGATCATCAGC-3'；Reverse primer：5'- ヰCTAGACGGCAGGTCAGGTC-3'。

1.2 標本來源 選取2008年1月-2009年10月在山東省腫瘤醫院胸外科行手術切除的NSCLC患者56例為病例組，良性肺病患者10例為對照組。病例組患者平均年齡59.98歲（36歲-37歲），腺癌26例，鱗癌24例，其它6例，高分化9例，中分化28例，低分化19例，有淋巴結轉移38例，無淋巴結轉移18例，I期13例，II期17例，III期23例，IV期3例。對照組患者平均年齡52.61歲（34歲-67歲），肺錯構瘤2例，肺炎性假瘤4例，肺結核4例。病例組采集術中切除的新鮮腫瘤組織和淋巴結組織，對照組采集病灶組織。手術結束編號標記后立即凍存于-80oC冰箱中備用。

1.3 方法 采用TRIzol法從組織中提取總RNA，紫外分光光度儀檢測RNA質量和純度；逆轉錄總RNA得到cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增出目的片段VEGF-C、EGFR和GAPDH；使用Geneamp Pcr System 9600型PCR擴增儀進行PCR反應，用TAE配制1.5%的瓊脂糖凝膠，在110 V電壓下擴增40 min，進行PCR產物電泳鑒定；用標準品DNA對PCR產物進行定量，取2 μL PCR產物加入18 μL ddH2O，取2 μL稀釋后的PCR產物加入18 μL SYBR，引物各0.5 μL，cDNA 2.5 μL，用不含RNA酶的水補至25 μL，短暫離心后進行擴增。擴增條件為95oC、10 s，然后以95oC 5 s，57oC 20 s，72oC 30 s循環40次，60oC、15 min后檢測信號；根據分子量計算出將1 μL樣品濃度調整為1×109個拷貝/mL所需加入ddH2O的量；分別加入相應體積液體將樣品稀釋成1×109個拷貝/mL，梯度稀釋制作標準曲線，根據樣品的CT值可以從標準曲線上讀出各個樣品的濃度（拷貝數/mL），管家基因的表達相對恒定，計算出目的基因的拷貝數與相同樣本的管家基因的拷貝數的比值作為目的基因的表達水平，從而得到計量資料。

1.4 統計學處理 應用SPSS 15.0軟件進行數據的統計分析。所有計量資料均應先經過單樣本K-S檢驗，判斷是否為正態分布。符合雙樣本均為正態分布的計量資料比較采用t檢驗、直線相關分析等方法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測VEGF-C和EGFR在腫瘤組織和淋巴結組織中的表達情況 以cDNA為模板，分別以VEGF-C、EGFR和GAPDH引物行PCR擴增，擴增出目的片段VEGF-C、EGFR和GAPDH，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。

2.2 熒光定量PCR檢測結果 目的基因VEGF-C、EGFR與管家基因的溶解曲線（圖2）的定量結果顯示，VEGF-C mRNA在肺癌組患者腫瘤組織及淋巴結組織中的表達水平高于良性肺病組（59.6±12.5 vs 42.8±8.5, P＜0.05），淋巴結轉移組表達水平高于無淋巴結轉移組（62.3±15.3 vs 48.2±12.6, P=0.001），肺癌組織中與淋巴結組織中VEGF-C mRNA表達水平呈同向變化，直線相關分析發現VEGF-C在腫瘤組織中的表達水平與淋巴結組織中的表達水平明顯相關（r=0.834, P＜0.001）（圖3A）。EGFR mRNA在肺癌組患者腫瘤組織中的表達水平高于良性肺病組（6.27±0.96 vs 5.37±0.48, P=0.015），淋巴結轉移組表達水平高于無淋巴結轉移組（6.19±0.90 vs 5.15±0.86, P=0.012），直線相關分析發現EGFR在腫瘤組織中的表達水平與淋巴結組織中的表達水平明顯相關（r=0.817, P＜0.001）（圖3B）。

圖 1 VEGF-C和EGFR在腫瘤組織（A）和淋巴結組織（B）中的表達。1：GAPDH；2：VEGF-C；3：EGFR；4：DNA marker。Fig 1 Expressions of VEGF-C (A) and EGFR (B) in tumor tissues and lymph node tissues. 1： GAPDH； 2： VEGF-C； 3： EGFR； 4： DNA marker.

圖 2 VEGF-C（A）和EGFR（B）的溶解曲線Fig 2 Dissolving curve of VEGF-C (A) and EGFR (B)

圖 3 VEGF-C（A）和EGFR（B）在腫瘤組織與淋巴結組織中表達的相關性Fig 3 VEGF-C (A) and EGFR (B) expressions in tumor tissues and lymph node tissues

3 討論

腫瘤的轉移、復發是一個多因子參與的復雜過程，新生血管和淋巴管的生成在腫瘤的發生和轉移過程中起著重要的作用。一些分子標志物的檢測可以指導治療、判斷預后，進而使患者獲益更大。VEGF家族是高度特異的內皮細胞有絲分裂原，可特異性促進內皮細胞生長及血管生成，增加血管的通透性，有助于腫瘤侵襲轉移，是目前誘導腫瘤血管生成作用最強、特異性最高的血管生長因子[4]。大多數腫瘤細胞本身、腫瘤浸潤的巨噬細胞和肥大細胞能分泌高水平VEGF。VEGF-C由7個外顯子組成，是一種針對淋巴管內皮細胞的有絲分裂原，具有刺激血管和淋巴管生成的雙重作用。多項研究提示，人類腫瘤表達的VEGF-C與腫瘤的轉移播散相關，且腫瘤進展過程與淋巴管生成有關，淋巴管生成已成為目前腫瘤轉移研究的熱點。Zhang等[5]應用實時定量聚合酶鏈反應技術研究VEGF-C在人乳腺癌組織中的表達，結果顯示VEGF-C mRNA表達與腫瘤淋巴結轉移明顯相關，并認為 VEGF-C表達是臨床評價乳腺癌淋巴侵襲擴散的指標之一。Mylona[6]研究了乳腺癌中VEGF-C蛋白表達與淋巴管、血管侵犯與腫瘤增殖的關系，結果顯示VEGF-C的表達更多的是通過脈管容量的增加而不單是通過淋巴管數量的增加來發揮作用。Li[7]利用RT-PCR、免疫組化方法檢測了VEGF-C在52例NSCLC患者手術切取的腫瘤組織和淋巴結組織中的表達，結果表明VEGF-C mRNA、VEGF-C蛋白表達水平與淋巴結轉移相關，可作為預測NSCLC淋巴結轉移的相關指標。

本研究選擇新鮮的冰凍腫瘤組織和淋巴結組織進行VEGF-C和EGFR表達研究，新鮮冰凍組織與石蠟包埋的組織相比為更好的研究對象，研究結果更可靠[8]。在實時熒光定量PCR反應中，本研究引入了一種熒光化學物質，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一個熒光信號強度，這樣我們就能通過熒光信號強度的變化監測產物量的變化。表示每個PCR反應管內熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數即為CT值。我們通過獲得未知樣品的CT值，然后從標準曲線上讀出樣品的拷貝數。本研究分析了VEGF-C與臨床病理特點的聯系，表明VEGF-C無論是在腫瘤組織中還是淋巴結組織中的表達均與淋巴結轉移有關，VEGF-C可以作為NSCLC淋巴結轉移的預測指標。腫瘤細胞內VEGF-C的過表達促進了腫瘤內淋巴管的生成，從而促進區域淋巴結的轉移。我們對腫瘤組織和淋巴結組織中VEGF-C表達的分析表明：VEGF-C mRNA的表達在有淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組有統計學差異（P=0.001）。NSCLC患者與良性肺部疾病患者腫瘤組織中與淋巴結組織中EGFR mRNA的表達均有統計學差異（P=0.001）。VEGF-C無論是在腫瘤組織中還是淋巴結組織中的表達，均與NSCLC的淋巴結轉移存在相關性。目前癌細胞經淋巴道播散的機制尚不明了，但VEGF-C與淋巴管形成的相關性是明確的，其導致轉移增高的原因可能包括：①VEGF-C與淋巴管內皮細胞的VEGFR-3結合，誘導VEGFR-3酪氨酸激酶磷酸化，增加瘤內、瘤周淋巴管的數目和管徑，提升了腫瘤淋巴轉移機會[9]；②VEGF-C可使血管、淋巴管的滲透性增加，可能是通過VEGFR-2和VEGFR-3介導實現的[10]；③VEGF-C通過改變腫瘤細胞與胞外基質的粘附性，提高癌細胞的粘附作用；④VEGF-C可作為一種趨化因子，這可能與其特殊的蛋白溶解酶作用有關，一方面增強腫瘤和特異器官的親和性，另一方面促進癌細胞向淋巴管方向移動，實現轉移。總之，VEGF-C參與人NSCLC的浸潤、轉移，但關于VEGF-C在肺癌發生、發展中的機制及與預后的關系尚需進一步研究。

EGFR是一種具有酪氨酸激酶活性的膜表面傳感器，普遍表達于人體的表皮細胞和基質細胞，并在多種人類惡性腫瘤中高表達，其所介導的信號轉導效應具有多向性，包括增殖、遷移、細胞分化和內環境的穩定等，與細胞的再生和惡性腫瘤的發生、發展密切相關。Pore等[11]研究表明，在晚期漿液性低分化卵巢癌中EGFR過度表達和腫瘤血管發生有關，腫瘤細胞有血液供應增殖更加迅速。Fresno等[12]使用RT-PCR技術檢測結果顯示EGFR在NSCLC組織中高表達，EGFR在NSCLC組織中的表達率明顯高于良性腫瘤和正常組織（P＜0.05），表明EGFR在肺腫瘤發生過程中可能起到了一定的作用。Tomov等[13]采用免疫組化方法研究了EGFR在良、惡性卵巢腫瘤中的表達情況，結果發現惡性卵巢組織EGFR的表達率明顯高于良性組織，差別有統計學意義；有腹水和進展期患者的EGFR表達率更高，研究表明卵巢癌細胞中EGFR的過度表達導致侵襲力增加。

本研究結果發現腫瘤組織及淋巴結組織中EGFR mRNA的表達在淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組有統計學差異，是EGFR表達與肺癌淋巴結轉移有關的直接證據，表明 EGFR參與了NSCLC的發展過程，所以，EGFR高表達往往反映了腫瘤的高侵襲力、高轉移性及預后不良，EGFR可以作為肺癌早期診斷轉移或微轉移，判斷預后的預測指標。本研究還表明NSCLC患者與良性肺部疾病患者的腫瘤組織與淋巴結組織中EGFR mRNA的表達水平均有統計學差異（P=0.015, P=0.020），但是目前關于肺癌患者與良性肺病兩組之間差異的報道還存在一定的矛盾[14]。

本研究中腫瘤組織和淋巴結組織中VEGF-C mRNA的表達經直線相關分析具有相關性，且腫瘤組織和淋巴結組織中EGFR mRNA的表達經直線相關分析亦具有相關性，提示VEGF-C和EGFR可能具有相似的生物學標記的意義，這將為采用淋巴結組織替代腫瘤組織檢測VEGF-C和EGFR提供了理論依據，有可能為患者提供一種更快捷、簡便的替代檢測方法，有助于減輕患者痛苦和經濟負擔，并對肺癌的早期診斷轉移或微轉移、評價預后及多靶點個體化治療的選擇奠定了理論基礎。