Cyr61和WISP-3在非小細胞肺癌組織中的表達及其臨床意義

呂建發 鄒友成 張純偉 毛志福

至今，已知CCN家族有6個成員，分別是Cyr61/CCN1（cystein-rich 61）、結締組織生長因子（CTGF/CCN2）、腎母細胞瘤過度表達基因（NOV/CCN3）、WNT誘導的分泌型蛋白-1（WISP-1/CCN4）、WISP-2/CCN5和WISP-3/CCN6，CCN家族是根據該家族中最初發現的3個成員Cyr61、CTGF和NOV的首字母命名的。

Cyr61被稱為潛在的腫瘤抑制基因，可抑制非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）腫瘤細胞的生長、浸潤、轉移[1]；WISP-3是CCN基因家族的一個新成員，有關其生物學特征的報道較少。近年來研究發現，WISP-3基因與某些腫瘤的發生發展有著密切關系，因此其成為CCN家族的研究熱點之一。本研究采用免疫組織化學方法對NSCLC標本中Cyr61和WISP-3表達進行檢測，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 武漢大學人民醫院胸外科2008年9月-2009年10月臨床確診的NSCLC癌組織（NSCLC組）及其相應的癌旁正常肺組織（對照組）標本各54例。患者男性41例，女性13例，年齡43歲-74歲，中位年齡56.2歲；病理類型：鱗癌32例，腺癌17例，腺鱗癌3例，細支氣管肺泡癌2例（編為“其它”）；腫瘤細胞的組織學分化程度分為高分化（I級）、中度分化（II級）和低分化（III級），組織學分級：I級9例，II級27例，III級18例；臨床分期：I-II期21例，III期-IV期33例。有淋巴結轉移者35例，無淋巴結轉移者19例。所有病例術前均未行放化療，并且均有完整的臨床資料、病理分級。

1.2 主要試劑 多克隆抗體兔抗人Cyr61（1:1 000）、羊抗人WISP-3（1:1 000）、SP試劑盒（通用型）均購自美國Chemicon國際有限公司。

1.3 實驗方法 所有組織標本均經10%福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋，切成4 μm厚切片，采用免疫組化SP染色法檢測NSCLC癌組織中Cyr61及WISP-3的表達情況。實驗中以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知的陽性NSCLC切片作為陽性對照，操作步驟按SP試劑盒說明書進行。

1.4 免疫組織化學染色結果判斷 以細胞漿呈不均勻棕黃色細顆粒狀、網狀或棕褐色團塊狀為陽性染色。本研究采用了既包括染色強度又包括染色范圍的4級計分系統以判斷染色結果[2]。每張切片在光鏡下隨機選取5個高倍視野，每個視野計數100個瘤細胞（異型增生）。根據染色強度計算：無染色0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；染色強度需與背景著色相對比。根據染色腫瘤細胞數占腫瘤細胞總數的比例計算：＜10%為1分；10%-50%為2分；＞50%為3分。再將上述兩種計分相乘，總分≤3分定義為基因表達明顯減少或缺乏（即陰性表達）；總分＞3分則被定義為基因表達陽性。所有的切片染色結果均由一位病理科醫生和作者共同作出判斷。

1.5 統計學方法 應用SPSS 13.0統計軟件包進行χ2檢驗，兩變量間相關分析采用Spearman等級相關分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Cyr61和WISP-3在NSCLC和正常肺組織中的表達情況 Cyr61主要在正常肺組織細胞質和細胞間隙中表達，可見很強的Cyr61蛋白表達（圖1A），而NSCLC癌組織中表達相對很弱（圖1B）；正常肺組織中Cyr61的陽性表達率為88.89%，NSCLC組織中Cyr61的陽性表達率為48.15%，差異具有統計學意義（χ2=20.776, P＜0.001）。與Cyr61表達的結果相反，WISP-3主要在癌組織細胞漿中表達， NSCLC患者的癌組織切片中可見很強的WISP-3表達（圖2A），而在癌旁正常肺組織切片中表達相對較弱（圖2B）；9例正常肺組織表達WISP-3（16.67%），36例NSCLC癌組織切片表達WISP-3（66.67%），差異具有統計學意義（χ2=33.75, P＜0.001）（表1）。

2.2 Cyr61和WISP-3蛋白表達的相關性 在NSCLC組中，Cyr61與WISP-3表達均陽性者14例，均陰性者3例；WISP-3陽性、Cyr61陰性者25例；WISP-3陰性、Cyr61陽性者12例，經Spearman等級相關分析顯示兩者呈負相關（r=-0.395, P=0.003）（表2）。

2.3 Cyr61和WISP-3表達與NSCLC臨床病理參數之間的關系 Cyr61的陽性表達與腫瘤的組織學分化程度、病理類型、臨床分期、家族史、吸煙史和淋巴結轉移有關（P＜0.05），與年齡、性別、肺結核病史和腫塊大體類型無關（P＞0.05）。Cyr61的陽性表達率隨組織學分化程度的升高而升高，高-中分化組陽性率（61.11%）明顯高于低分化組（22.22%）（P=0.007）；隨臨床分期的升高而下降，臨床III期-IV期表達（33.33%）明顯低于I期-II期（71.43%），差異有統計學意義（P=0.006）。

表 1 Cyr61和WISP-3在NSCLC和正常肺組織中的表達情況Tab 1 Expressions of Cyr61 or WISP-3 in NSCLC and normal lung tissue

表 2 Cyr61、WISP-3在NSCLC中表達的相互關系Tab 2 The relationship between the expressions of Cyr61 and WISP-3 in NSCLC

圖 1 Cyr61在正常肺組織及非小細胞肺癌組織中的陽性表達。A：Cyr61在正常肺組織中陽性表達（SP，×200）；B：Cyr61在非小細胞肺癌組織中陽性表達（SP，×200）。Fig 1 Expression of Cyr61 in normal lung tissue and NSCLC tissue. A： Expression of Cyr61 in normal lung tissue (SP, ×200)； B： Expression of Cyr61 in NSCLC tissue (SP, ×200).

圖 2 WISP-3在正常肺組織及非小細胞肺癌組織中的陽性表達。A：WISP-3在正常肺組織中陽性表達（SP，×200）；B：WISP-3在非小細胞肺癌組織中陽性表達（SP，×200）。Fig 2 Expression of Cyr61 in normal lung tissue and NSCLC tissue. A： Expression of WISP-3 in normal lung tissue (SP, ×200)； B： Expression of WISP-3 in NSCLC tissue (SP, ×200).

鱗癌組Cyr61表達的陽性率（62.5%）明顯高于腺癌組（29.41%）（P=0.027）；有家族史組Cyr61表達的陽性率（16.67%）明顯低于無家族史組（57.14%）（P=0.013）；淋巴結轉移陽性組Cyr61的表達率（25.71%）明顯低于淋巴結轉移陰性組（78.95%）（P＜0.001）；吸煙史組Cyr61表達率（32.35%）明顯低于無吸煙史組（75%）（P=0.002）。WISP-3陽性表達率與腫瘤的組織學分化程度、臨床分期和年齡有關（P＜0.01），而與其它臨床指標無關（P＞0.05）。WISP-3的陽性表達率隨組織學分化程度的升高而降低，低分化組陽性率（94.44%）明顯高于高中分化組（61.11%）（P=0.01）；隨臨床分期的升高而升高，臨床III期-IV期表達率（84.85%）明顯高于I期-II期（52.38%），差異有統計學意義（P=0.009）；≥60歲組WISP-3的陽性表達率（90%）明顯高于＜60歲組陽性表達率（50%）（P=0.001）（表3）。

3 討論

本研究顯示，癌組織中Cyr61表達水平低于癌旁正常肺組織，提示Cyr61在NSCLC的發生發展中可能是抑癌基因；相反，癌旁正常肺組織中WISP-3表達水平明顯低于癌組織，推測WISP-3可能是NSCLC的致癌基因。有報道指出，Cyr61基因對多種組織的腫瘤細胞起調控作用。人胰腺癌腹膜轉移癌的癌組織中Cyr61高表達[3]；卵巢癌Cyr61能夠刺激細胞增殖并抑制細胞凋亡，在其發生過程中起重要作用[4]。有文獻[1,5]報道，Cyr61是NSCLC生長過程中的一個腫瘤抑制基因，Cyr61能夠促使p53上調，而后引發一系列的信號轉導，阻滯細胞周期的G1期。Gery等[4]通過轉染實驗證實：以不含內源性Cyr61基因的NSCLC細胞株為實驗材料，用Cyr61的cDNA表達子轉染的NSCLC細胞株表達的克隆數比用相同數量的陰性表達子轉染的NSCLC細胞株表達的克隆數少60%-90%。WISP-3已被證實與腫瘤生長有關，在不同類型的腫瘤中可能起著正向調節或負向調節腫瘤生長的作用。Kleer等[6,7]研究發現，在炎性乳腺癌組WISP-3基因是一種抑癌基因，具有抑制腫瘤細胞增殖、侵犯周邊組織、血管生成及促進細胞分化的作用。另有研究結果[8-11]表明，在結直腸癌、異常微衛星不穩定性胃癌、肝細胞癌的研究中發現WISP-3在這些腫瘤組織中呈高表達或突變狀態。Davies等[12]研究表明，在乳腺癌組織中WISP-1是一種抑癌基因，WISP-2為一種腫瘤刺激因子，而WISP-3與腫瘤的發生與發展無確切關系。

表 3 Cyr61和WISP-3表達與NSCLC臨床病理參數之間的關系Tab 3 The relationship between the expression Cyr61 and WISP-3 and the clinical parameters of NSCLC

統計分析顯示，臨床參數對Cyr61及WISP-3表達有重要影響。統計分析顯示，病理組織學低分化組的Cyr61表達水平明顯低于高分化組，臨床分期晚組明顯低于分期早組。Yu等[13]也報道在病理組織學分化低的軟骨肉瘤中低表達Cyr61，這與NSCLC中的情況是一致的。Cyr61的陽性表達與家族史、吸煙史和淋巴結轉移有關，與Cui等[14]的研究相一致。有淋巴結轉移的腫瘤中Cyr61表達量低于無淋巴結轉移的腫瘤，這些結果提示Cyr61可能是反映NSCLC生物學行為和預后的重要標記物。WISP-3陽性表達率與腫瘤的組織學分化程度、臨床分期和年齡等有關。根據癌組織和癌旁正常組織中的表達水平可以證實，對于肺癌來說，Cyr61是抑癌基因而WISP-3是致癌基因。可見Cyr61和WISP-3單個基因或兩者相互作用對肺癌的發展起重要作用，其表達的蛋白產物可作為臨床干預治療的重要靶蛋白。對CCN與腫瘤關系的進一步研究和分子機理的深入闡明將會對腫瘤的早期診斷、治療和預防提供理論依據。

本研究顯示，在NSCLC組織中Cyr61和WISP-3蛋白表達呈密切負相關（r=-0.395, P=0.003），提示兩者之間的恒定比例和一定表達水平對正常肺組織的維持非常重要，Cyr61和WISP-3的表達失衡在NSCLC發生和發展過程中起重要作用，其作用機制有待進一步探討。