肺腺癌組織中IGF-IR表達與患者臨床病理因素及預后的相關性

張雪艷 馮久賢 沙惠芳 黃進肅 韓寶惠

近年來，肺癌發病率不斷升高，而非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌的80%。其中肺腺癌是NSCLC最主要的組織類型之一，其發病率不斷升高，因而，對肺腺癌的細胞起源及癌變機制的研究受到國內外學者的高度關注。胰島素樣生長因子I受體（insulin-like growth factor I receptor, IGF-IR）是多種生長因子調控樞紐，在細胞生長、分化過程中起重要調節作用。越來越多的資料表明，IGF-IR在腫瘤組織中存在不同程度的異常表達，并在腫瘤細胞分化分裂、增殖凋亡中扮演重要角色。本研究旨在探討IGF-IR在肺腺癌中的表達及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集上海交通大學附屬胸科醫院1999年1月-2004年6月經外科根治性手術切除且隨訪資料完整的126例肺腺癌患者納入本研究。患者年齡22歲-80歲，中位年齡57歲；男性65例，女性61例。按國際抗癌聯盟（International Union Against Cancer, UICC）標準進行分期，Ib期30例，II期39例，IIIa期57例。高分化30例，中分化76例，低分化20例。隨訪從手術之日開始，末次隨訪日為2009年12月15日，本組患者的隨訪時間均＞5年。所有患者術前均未進行過放療或化療，術后接受2次-4次以鉑類為主的化療。手術標本經4%甲醛固定，石蠟包埋，制成4 μm厚切片。由兩位病理科主任、副主任對原發病灶的病理切片進行審核，明確病理診斷。

1.2 免疫組化檢測IGF-IR表達 免疫組化技術采用Supervision法，肺腺癌患者癌旁的正常肺組織作為陰性對照。具體操作步驟如下：石蠟切片60oC，烘片1 h-2 h；二甲苯脫蠟3次，每次20 min，梯度乙醇水化后蒸餾水沖洗3次；PBS沖洗，5 min×3次；二甲苯脫蠟后，用檸檬酸緩沖液pH 6.0（上海長島生物技術有限公司）進行高溫高壓抗原修復，修復時間120 s；用PBS沖洗3次，每次3 min-5 min；切片滴加兔抗人IGF-IR單克隆抗體（DA-KO公司）50 μL，于4oC環境過夜；用PBS沖洗3次，每次3 min-5 min；滴加50 μL第二抗體Supervision（上海長島生物技術有限公司）（按試劑盒使用），室溫下孵育40 min；用PBS沖洗3次，每次3 min-5 min；每張切片滴兩滴約100 μL的DAB顯色液，顯微鏡下觀察3 min-5 min；蘇木精染色5 min，沖洗20 min；1%鹽酸酒精分化，沖洗20 min；切片經95%、100%乙醇各兩檔脫水，放入電熱恒溫鼓風干燥箱風干；二甲苯透明，中性樹脂封固。

1.3 免疫組化評定標準 免疫組化結果由兩位病理科主任、副主任對切片進行審核。IGF-IR表達主要以細胞膜及胞質混合型表達為主，陽性染色呈棕黃色顆粒。評定用半定量方法：總的評定分數根據染色陽性細胞數的比率和染色強度。染色陽性細胞定量：＜5%為0分，5%-25%為1分，26%-50%為2分，＞50%為3分；染色強度：無染色為0分，染黃色為1分，染棕色為2分。最終的表達評定分數為：染色細胞定量分數×染色強度分數，分別為0分-1分為陰性（-），2分-3分為弱陽性（+），4分-6分為陽性（++）。

1.4 統計分析 實驗數據應用SPSS 11.0統計軟件進行分析處理。組間率的比較采用χ2檢驗。Kaplan-Meier方法計算生存曲線，用Log-rank進行差異檢驗。生存分析采用Cox單因素及多因素分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IGF-IR在肺腺癌組織中的表達 IGF-IR主要以細胞膜及胞質混合型表達為主，陽性染色呈棕黃色顆粒（圖1）；126例患者中89例表達陽性，其中18例（++），71例為（+）。陽性率為70.63%。

2.2 IGF-IR表達與臨床病理特征的關系 IGF-IR表達與肺腺癌患者腫塊大小及T分期相關，與患者年齡、性別、吸煙史、腫瘤分化、病理分期及CEA等指標無關（P＞0.05）（表1）。

2.3 IGF-IR表達與轉移和療效的關系 126例患者中，95例發生轉移，其中69例為IGF-IR陽性表達。85例患者可隨訪到轉移后化療療效。IGF-IR表達與否與是否轉移、轉移途徑、轉移部位及轉移后化療療效均無統計學差異（表2）。

2.4 IGF-IR表達與肺腺癌患者生存期的相關性 進一步分析IGF-IR和肺腺癌患者生存期的相關性，用Log-rank進行分析，結果表明，126例肺腺癌患者中，IGF-IR表達情況對生存期的影響無統計學差異。生存曲線趨勢也表明，IGF-IR表達對患者生存無明顯的影響（圖2）。

2.5 肺腺癌患者生存期影響因素的Cox回歸模型分析 Cox比例風險回歸模型對影響患者預后的多項因素進行單因素分析表明：年齡、病理分期、N分期、CEA、是否轉移、轉移后化療療效均影響患者的生存。進行多因素分析顯示，是否轉移、轉移后化療療效均是影響生存期的獨立因素。無轉移的患者較有轉移的患者生存期長（P＜0.001），相對危險度為0.005（95%CI:0.001-0.043）。此外，轉移后化療效果好的患者比化療效果不佳的患者預后好（P＜0.001），相對危險度為1.969（95%CI: 1.423-2.726）（表3）。

3 討論

IGF-IR是一種酪氨酸蛋白受體，它的主要作用是介導IGF-I和IGF-II的促生長活性。當配體與IGF-IR的亞單位中的結合部位結合后，激活位于胞內的酪氨酸激酶，引起胞內信號轉導，進一步引起細胞分裂分化和組織器官的生長發育。細胞的正常增殖分化和機體的正常發育均受IGF-IR介導的各信號傳導途徑的調節，當IGF-IR介導的信號傳導失常時，機體可能形成腫瘤。IGF-IR在腫瘤的發生發展過程中起著多方面的作用，如促進細胞向惡性表型轉化、促進腫瘤細胞生長和分裂增殖、抑制腫瘤細胞凋亡并與腫瘤的浸潤有密切關系。研究發現IGF-IR在肺癌、肝癌、前列腺癌中呈過度表達。

表 1 IGF-IR表達與肺腺癌臨床病理特征的相關性Tab 1 Correlation between IGF-IR expression and clinicopathological factors in 126 patients with lung adenocarcinoma

圖1 IGF-IR在肺腺癌組織中呈不同程度表達（免疫過氧化物酶染色，×200）。A：IGF-IR表達（++）；B：IGF-IR表達（+）；C：IGF-IR表達（-）。Fig 1 Immunohistochemical staining of IGF-IR protein in lung adenocarcinoma tissues (immunoperoxidase stain, ×200). A： strong staining in the most of the lung adenocarcinoma cells (++)； B： weak-moderate staining in lung adenocarcinoma cells (+)； C： negative staining in lung adenocarcinoma cells (-).

表 2 IGF-1R表達與肺腺癌患者的轉移及療效的相關性Tab 2 Correlation between IGF-1R expression and metastasis and chemotherapy efficacy in 126 patients with lung adenocarcinoma

圖2 IGF-IR表達與肺腺癌生存期的關系（Logrank=0.08, P=0.775）Fig 2 Cumulative Kaplan-Meier survival curves for patients with IGF-IR (Log-rank=0.08,P=0.775)

表 3 肺腺癌患者生存期影響因素的Cox回歸模型分析結果Tab 3 Univariate and multivariate analysis of clinicopathological factors for the overall survival rate of 126 patients with lung adenocarcinoma

本研究發現，IGF-IR表達與患者腫塊大小和T分期相關，病灶大及T分期晚的患者IGF-IR表達增高。其可能的機制為：IGF-IR既可以結合IGF-I，又與IGF-II具有很強的親和力，在IGF信息傳導通路中發揮重要作用。正常情況下，細胞表面的IGF-IR對細胞凋亡無明顯的影響。細胞癌變時，各種癌基因和抑癌基因的突變及相互作用而致腫瘤細胞中IGF-IR基因表達異常。表達IGF-IR的腫瘤細胞通過合成和分泌內生性IGFs，借助IGFs/IGF-IR環路刺激腫瘤細胞無限增殖，并維持其惡性表型。IGF-IR的過度表達可以阻止肺癌等腫瘤細胞的凋亡，且與腫瘤的浸潤性生長、轉移關系密切。在實驗研究中發現，通過抗IGF-IR抗體、IGF-I類似物或反義RNA使IGF-IR功能失活或數目減少，均可導致相應腫瘤細胞系大批凋亡，阻止體外增殖，并使其在同源動物或裸鼠體內的致瘤性喪失，可見，IGF-IR在建立和維持肺腫瘤轉化表型中扮演著重要角色，可以成為抑制細胞增殖的合適靶點。

本研究也發現，IGF-IR表達與患者腫塊大小和T分期相關，而與患者年齡、性別、吸煙史、腫瘤分化、病理分期、遠道轉移及CEA等指標均無關，且與是否轉移、轉移途徑、轉移部位及轉移后化療療效均無關。生存曲線趨勢也表明，IGF-IR表達對患者生存無明顯的影響。因此，IGF-IR可能并非有效的預測肺腺癌療效及預后的標志。近年研究[1,2]發現，IGF-IR在乳腺癌中表達與疾病進展及放療耐藥相關，且預示不良預后。對IGF-IR表達與臨床指標及預后的關系，各家報道不一致，目前仍有爭論。有關前列腺癌和乳腺癌的研究[3,4]顯示，早期腫瘤和正常組織中IGF-IR表達增多，而進展性癌表達減少。IGF-IR表達提示預后良好，而在軟組織肉瘤的研究中也支持這一觀點[5]。而也有相反的觀點認為，IGF-IR揭示不良的預后[6,7]。對肺癌的研究較少，Merrick等[8]的研究表明，IGF-IR在肺腺癌中表達高于其它組織類型，有統計學意義，且與不良預后有關。而Lee等[9]對71例I期NSCLC的研究表明，IGF-IR表達與臨床指標（如性別、組織類型、分期、分化等）無相關性，且和患者預后無相關。而最近Ludovini等[10]研究發現VEGF和IGF-IR共表達的患者預后不良，而單獨IGF-IR表達和預后無關。最近的一項研究[11]通過對189例NSCLC的手術標本進行檢測IGF-IR，發現IGF-IR表達與EGFR表達具有相關性，且IGF-IR蛋白表達與肺癌患者分期有關，但與肺癌患者的生存無關。因此，目前對IGF-IR對肺癌患者預后及臨床指標關系的觀點說法不一，本研究顯示，IGF-IR表達與肺腺癌轉移及預后等無關。

Cox單因素和多因素分析表明：年齡、病理分期、N分期、CEA、轉移及轉移后化療療效均是患者生存期的影響因素。高齡患者易進展，這可能與老年患者心肺功能相對較差，以及對手術的耐受性不如年輕患者好等因素有關；CEA也與病情進展有關，而多因素分析表明，是否發生轉移及轉移后療效均是影響生存期的獨立因素。患者出現轉移后，依據轉移部位，臨床醫生所選擇的治療方法不同，包括化療、放療、再次手術等。而且轉移的部位不同，化療方案也不盡相同，如DP、D、Meccnu+VM26、GP、TP等。由于方案種類較多，且每種病例數較少，故未進行化療方案與預后關系的分析。共有85例可隨訪至有化療療效，分析療效與預后的關系發現二線化療療效為預后的獨立影響因素，而IGF-IR并非影響患者預后的獨立因素。因此，IGF-IR與腫瘤的形成、侵襲、腫瘤細胞增殖等相關，可能成為抑制細胞增殖的作用靶點，但并不適合作為預測療效及預后的適合指標。