非小細胞肺癌患者腫瘤組織與外周血中EGFR表達相關性研究

郭琛 郭其森 曾洪生 禚銀玲 管燕 劉秀菊

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）是一種細胞膜表面的糖蛋白受體，具有酪氨酸激酶活性，是原癌基因C-erb-1的表達產物。EGFR的高表達可以促進腫瘤血管生成以及腫瘤細胞的增殖、粘附、侵襲、轉移[1]。正常肺組織中，EGFR低表達或不表達，而在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中EGFR常表現為活性增高[2]，據文獻報道其表達率為23%-89%。

盡管組織學類型、臨床分期相同且采用的治療方法相同，部分患者卻出現不同的結果。因此，利用已知腫瘤細胞特點作為個體化治療的探索，有助于提高療效。本研究旨在通過對分子學指標的檢測為治療方式的選擇、術后的輔助治療、預測化療耐藥、提供阻斷方法、評價預后提供更準確的依據。

1 材料和方法

1.1 一般資料 選取2007年1月-2007年10月在山東省腫瘤醫院胸外科行手術切除的NSCLC患者46例為病例組及良性肺病變患者10例做對照組。病例組男性38例，女性8例；年齡36歲-74歲，中位年齡61.5歲。不吸煙者18例，≤400年支者7例，＞400年支者21例。腺癌21例，鱗癌20例，其它5例。I期11例，II期14例，IIIa期19例，IV期2例。

1.2 試劑與引物設計 羊抗人EGFR ELISA試劑盒為美國Adlitteram Diagnostic Laboratories產品。采用QIAGEN公司的AllPrep DNA/RNA Mini Kit試劑盒抽提組織標本中的RNA，反轉錄試劑盒ScriptTMRT reagent kit（Perfect Real Time）為TaKaRa公司產品。PCR試劑包括：dNTP（10 mM）（GENERAY BIOTECH公司）、PCR Buffer（10×）（QIAGEN公司）、Hotstar taq（QIAGEN公司）、PCR產物純化試劑盒（CR Purification Kit: To PureTM, Gene Tech）、real-time PCR試劑盒[SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time），TaKaRa公司]。采用Primer Premier5軟件設計引物，EGFR上游：5'-GGACTCTGGATCCCAGAAGGT G-3'，EGFR下游：5'-GCTGGCCATCACGTAGGCTT-3'，產物大小為244 bp；內參引物為GAPDH，GAPDH上游：5'-CAACAGCCTCAAGATCATCAGC-3'，GAPDH下游：5'-TTCTAGACGGCAGGTCAGGTC-3'，產物大小為306 bp；由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 標本的收集 病例組采集術后新鮮腫瘤組織，對照組采集病灶組織。每例均采集正常肺組織及手術前6 h、手術后24 h外周靜脈血4 mL。組織標本及分離出的血漿置入-80oC冰箱中保存。

1.4 EGFR在腫瘤組織中表達的檢測 RNA抽提完成后，將RNA反轉錄為cDNA，反應條件為37oC、15 min，85oC、5 s。以cDNA為模板進行PCR擴增目的片段EGFR和GAPDH，PCR反應條件為95oC、15 min，94oC、30 s，63oC、1 min（touch down，每個循環減0.5oC），72oC、1 min（15個循環），94oC、30 s，56oC、1 min，72oC、1 min（30個循環），72oC、10 min。PCR產物需電泳鑒定及純化，并用標準品DNA對PCR產物進行定量。完成后梯度稀釋制作標準曲線進行real-time PCR，反應條件為95oC、10 s，95oC、5 s，57oC、20 s，72oC、30 s（40個循環），95oC、15 s，60oC、1 min，95oC、15 s（即溶解曲線）。采用絕對定量的方法進行real-time RT-PCR的檢測，根據樣品的CT值可以從標準曲線上讀出各個樣品的濃度（拷貝數/mL），計算出目的基因的拷貝數與相同樣本的管家基因的拷貝數的比值作為目的基因的表達水平，從而得到計量資料（圖1）。

1.5 EGFR在外周血中表達的檢測 按試劑盒說明對血漿標本進行ELISA檢測，在全波長掃描酶標儀450 nm處檢測光密度（optical density, OD）值。EGFR標準品的濃度分別為0、50 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL、400 pg/mL、800 pg/mL，試劑盒的最大檢測濃度為800 pg/mL，檢測靈敏度為1.0 pg/mL。標準曲線方程為Y=144.93X-14，R2=0.997 7。

1.6 統計學方法 應用SPSS 10.0軟件進行統計分析，檢驗水準α=0.05（雙側）。所有計量資料均應先經過單樣本K-S檢驗，判斷是否為正態分布。符合雙樣本均為正態分布的計量資料比較采用獨立樣本t檢驗、配對t檢驗、方差分析、直線相關分析等方法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EGFR在外周血中的表達

2.1.1 與臨床病理特征的關系 血漿EGFR蛋白表達水平與性別、年齡、腫瘤大小、病理類型、腫瘤分化程度等因素無關，與有無淋巴結轉移、吸煙指數有關（表1）。

2.1.2 腫瘤與良性疾病的比較 NSCLC患者中EGFR表達為（5 069±3 550）pg/mL，良性肺部疾病患者中EGFR表達為（4 930±2 097）pg/mL，兩者相比差異無統計學意義（t=0.086, P=0.932）。

2.1.3 手術前后的比較 NSCLC患者術前EGFR表達為（4 777±2 150）pg/mL，術后為（2 960±1 006）pg/mL，兩者比較差異具有統計學意義（t=5.28, P＜0.001）。在手術后患者的表達水平上，腺癌組為（3 703±1 138）pg/mL，鱗癌組為（2 655±804）pg/mL，腺鱗癌組為（2 374±533）pg/mL，腺癌組與鱗癌組間存在明顯差異（t=2.96,P=0.006），腺癌組與腺鱗癌組間亦有明顯差異（t=2.22,P=0.04）。

2.2 EGFR在腫瘤組織中的表達 腫瘤組織中EGFR mRNA的表達與性別、年齡、腫瘤大小、病理類型、腫瘤分化程度、吸煙等因素無關，與有無淋巴結轉移有關（表2）。

2.3 EGFR在腫瘤組織中與外周血中表達的相關性分析 采用直線相關的方法對腫瘤組織和外周血中EGFR的表達進行相關性的分析。利用同一樣本的GAPDH作為EGFR的內參進行組織樣本的檢測。血漿中EGFR的表達水平與NSCLC腫瘤組織中EGFR mRNA的表達水平呈正相關（R2=0.83, P=0.016）（圖2）。腫瘤組織中EGFR的表達與外周血中的表達均顯示出明顯的相關性，腫瘤組織中表達水平越高，外周血中的蛋白表達水平越高。這些數據提示：外周血中的蛋白可能來源于腫瘤組織的分泌。

表 1 EGFR手術前外周血中表達水平與臨床病理特征的相關性Tab 1 Relationship of the EGFR expression in peripheral and blood clinicopathological characteristics between groups before operation

3 討論

肺癌已成為我國第一大癌癥，且發病率和死亡率增長最為迅速。淋巴結轉移是NSCLC的主要轉移途徑之一。胸部CT檢查是最常用的NSCLC腫瘤分期和淋巴結轉移情況評估的非創傷性檢查，主要是通過淋巴結的大小和形狀來判斷是否有轉移，但這樣可能漏診一些較小的轉移淋巴結或者誤診較大的非轉移性淋巴結（如炎癥）。縱隔鏡和PET可進行更精確的淋巴結轉移檢查。血液中相關因子的檢測創傷小并且費用低，在沒有PET的醫院里或患者承受高額費用較困難時，是一種更可行的途徑。分子生物學以腫瘤發生發展機制相關的腫瘤基因、腫瘤基因蛋白產物、生長因子及受體家族等為標記物，運用現代技術如免疫組化、PCR 、流式細胞儀等，主要對原發瘤、淋巴結、骨髓、外周血高特異性高敏感性檢測臨床常規檢查未發現的腫瘤散播，從而為肺癌早期診斷轉移或微轉移 （micrometastasis）、治療方式的選擇、術后的輔助治療、預測化療耐藥、提供阻斷方法、評價預后提供更準確的依據。

EGFR信號通路主要分為：配體誘導胞外域構象變化、跨膜信號轉導、胞內域形成激酶活性與下游信號激活、信號滅活四部分。EGF誘導EGFR胞外域進行構象變化，通過二聚化/寡聚化解除胞外域對胞內域激酶活性形成的抑制作用，促使胞內域相互作用形成激酶活性并完成胞內域酪氨酸殘基的磷酸化。磷酸化的胞內域作為結合位點（docking sites）招募其它信號分子并依賴RTK活性完成對下游信號分子的磷酸化，啟動信號轉導通路。信號激活與滅活的協調控制是生物體正常機制實現的基礎，EGFR信號滅活過程主要有內化與降解兩部分[3]。

表 2 EGFR在癌組織中的表達與臨床病理特點的相關性Tab 2 Correlation of the EGFR expression in tumor tissue and clinicopathological chara cteristics between groups after operation

在NSCLC中，多項研究進行了血清EGFR蛋白表達的檢測。Sasaki[4]的研究共有106例肺癌患者和16例良性病變患者入組，所有患者都在未進行任何治療前采集外周血標本。肺癌組（21.275±22.035）fm/mL與良性對照組（22.630±7.330）fm/mL表達無明顯差異（P=0.808 3），說明血清EGFR蛋白的表達在鑒別良惡性方面有一定的局限性。肺癌患者中有淋巴結轉移組（23.515±20.065）fm/mL和無淋巴結轉移組（16.390±10.970）fm/mL的表達水平有明顯差異（P=0.022 8），說明血清EGFR蛋白的表達在判斷淋巴結轉移方面有一定的意義。肺癌的不同病理類型中表達無明顯差異，血清EGFR正常組和血清EGFR升高組預后無明顯差異。Miura[5]采用肺癌患者外周血抽提的mRNA進行real-time RT-PCR研究其作為腫瘤標記物的價值和意義，共112例肺癌患者和80例非惡性腫瘤患者入組，研究結果表明血清EGFR mRNA與腫瘤數目、臨床分期有關（P＜0.05）。血清EGFR mRNA對肺癌診斷的敏感性和特異性分別是71.3%和80.0%。在肺癌組中，血清EGFR mRNA與腫瘤組織中EGFR mRNA呈明顯的相關性（P＜0.05）。

本研究選擇新鮮的冰凍癌組織進行EGFR研究，較石蠟包埋的組織，新鮮冰凍腫瘤組織是更好的研究對象，研究結果更可靠[6]。以往研究[7]中較多采用免疫組化來對腫瘤組織中的表達進行檢測，另外還有熒光原位雜交、CISH[8]等技術。本研究采用real-time RT-PCR法進行研究，對表達水平進行定量，得到計量資料，使相關性的分析更加精確。實時熒光定量PCR技術是通過對PCR反應擴增中每一個循環產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板的定量和定性分析。在實時熒光定量PCR反應中，引入一種熒光化學物質，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一個熒光信號強度，這樣就能通過熒光信號強度的變化監測產物量的變化。表示每個PCR反應管內熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數即為CT值。通過獲得未知樣品的CT值可以從標準曲線上讀出樣品的拷貝數。管家基因的表達相對恒定。

圖 1 Real-time RT-PCR結果Fig 1 Result of real-time RT-PCR

本研究表明：①經直線相關分析，EGFR在腫瘤組織中的表達與外周血中表達的水平存在相關性（R2=0.83,P=0.016）。外周血檢測是一種創傷小而且更加方便可行的檢測方法，外周血中EGFR與腫瘤組織的表達具有相似的生物學標記的意義；②腫瘤組織和外周血中EGFR高表達水平與淋巴結轉移有關，可作為肺癌淋巴結轉移的標記物；③NSCLC患者血清EGFR蛋白表達水平與性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、病理類型無關；④外周血中EGFR的表達方面，吸煙指數≤400年支組（3 913±1 753）pg/mL與吸煙指數＞400年支組（4 936±1 752）pg/mL的差異有統計學意義（P=0.047）。研究[9,10,11]報道NSCLC患者吸煙與EGFR突變有關，不吸煙的患者應用吉非替尼治療效果好。本研究結果顯示吸煙對EGFR表達量也有影響，EGFR突變與表達量之間可能也存在一定的相互作用，值得我們進一步探討；⑤NSCLC患者手術前后血清EGFR蛋白表達水平顯示出明顯差異，考慮主要原因為腫瘤負荷減小，腫瘤分泌的EGFR減少。正常人每日約需要攝入（2 000-2 500）mL水，手術前患者每日輸液量大約為（500-1 000）mL，手術后患者每日輸液量大約為（1 000-1 500）mL，考慮到手術中失水和手術后短暫禁食禁水的影響，術后采集的外周血由于輸液被稀釋的因素基本可以忽略。而手術后表達水平在不同病理類型差異明顯，腺癌組的表達明顯較鱗癌組和其它組高；⑥本研究EGFR表達在肺癌組和良性肺病組血清中未顯示出統計學差異（P=0.932），可能與良性肺病組樣本量小有關，但多數報道認為血清EGFR在肺癌患者和正常人之間的表達是有差異的。

圖 2 EGFR在腫瘤組織與外周血中表達的相關性Fig 2 Correlation between the EGFR expression in tumor tissue and in peripheral blood

綜上所述：NSCLC患者EGFR腫瘤組織mRNA和外周血中表達經直線相關分析存在相關性，外周血檢測創傷小且方便可行，有可能替代腫瘤組織，具有相似的生物學標記的意義；外周血EGFR蛋白的高表達水平可能作為淋巴結轉移的標記物，對肺癌的早期診斷轉移或微轉移、個體化治療的開展提供一個更為簡單的檢測方法。