IL-7/IL-7R在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及與淋巴轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系

明健 張清富 姜彥多 邱雪杉 白曉忠

白介素-7（interleukin-7, IL-7）是一種細(xì)胞因子，它主要由胸腺細(xì)胞[1,2]、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、小腸上皮細(xì)胞[3]和皮膚角化細(xì)胞[4]等分泌，在人體免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育和維持正常免疫功能中起重要作用。IL-7在維持人體免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中起重要作用。同時(shí)，它能誘導(dǎo)造血細(xì)胞和血液惡性腫瘤細(xì)胞（如：白血病和淋巴瘤）生長(zhǎng)和增殖[5-10]。但是，關(guān)于它在實(shí)體腫瘤中的表達(dá)和作用的研究較少。IL-7在肺癌組織中如何表達(dá)及其表達(dá)與肺癌轉(zhuǎn)移是否存在相關(guān)性尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將探討非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）組織中IL-7、IL-7受體（interleukin-7 receptor, IL-7R）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-D（vascular endothelial growth factor-D, VEGF-D）表達(dá)與臨床病理因素、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 選取1980年1月-2001年12月在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院行肺癌根治性切除且有完整隨訪資料的NSCLC組織95例。同時(shí)取相應(yīng)的癌旁肺組織做對(duì)照，所取癌旁肺組織距癌灶邊緣5 cm以上，并且經(jīng)HE染色證實(shí)。所有患者術(shù)前均未接受過(guò)任何放療或化療，男性71例，女性24例；年齡32歲-72歲（58.50歲±8.96歲）。按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟（International Union Against Cancer, UICC）1997年修訂的肺癌pTNM分期標(biāo)準(zhǔn)，I期33例，II期9例，III期53例；中高分化56例，低分化39例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移58例。所有標(biāo)本的使用均征得患者本人同意。生存時(shí)間的計(jì)算是從手術(shù)日期到由于復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移而死亡的日期或末次隨訪日期為止，隨訪期1個(gè)月-117個(gè)月，平均23.84個(gè)月，隨訪中發(fā)現(xiàn)47例患者發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，其中腦轉(zhuǎn)移19例、骨轉(zhuǎn)移14例、腎上腺轉(zhuǎn)移14例。

1.2 方法 95例原發(fā)性NSCLC癌組織及癌旁正常肺組織標(biāo)本，用中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成4 μm切片，采用SP法檢測(cè)組織中IL-7、IL-7R和VEGF-D蛋白表達(dá)情況以及微血管密度（microvessel density, MVD）和淋巴管密度（lymphatic vessel density, LVD）。高溫高壓抗原修復(fù)，一抗IL-7（1:100）、IL-7R（1:100）、VEGF-D（1:150）抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz，D2-40抗體和CD34抗體分別購(gòu)自DAKO和美國(guó)Lab Vision。SP試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine, DAB）酶底物顯色試劑盒（DAB-0031）購(gòu)自邁新公司。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定：IL-7、IL-7R和VEGF-D以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性顯色。光鏡下每張切片選取癌細(xì)胞較多的10個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)癌細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，IL-7、IL-7R和VEGF-D的評(píng)估為：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為“-” ，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%為“+” ，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占6%-20%為“++” ，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞20%為“+++” ，其中“++”和“+++”為高表達(dá)，“-”和“+”為低表達(dá)。血管和淋巴管判定標(biāo)準(zhǔn)參考Weinder[11]標(biāo)準(zhǔn)。血管和淋巴管判定標(biāo)準(zhǔn)為：內(nèi)皮細(xì)胞形成條狀、裂隙狀等孤立結(jié)構(gòu)棕黃染色或有管腔者按一條血管或淋巴管計(jì)數(shù)。低倍光鏡下確定3個(gè)微血管或淋巴管高密度區(qū)域（熱點(diǎn)），然后在高倍鏡下分別計(jì)數(shù)每個(gè)熱點(diǎn)中3個(gè)區(qū)域的CD34染色（用于標(biāo)記MVD）和D2-40（用于標(biāo)記LVD）染色陽(yáng)性管腔數(shù)均值。MVD=（CD34陽(yáng)性管腔數(shù)-D2-40陽(yáng)性管腔數(shù)）均值；LVD=D2-40陽(yáng)性管腔數(shù)均值。當(dāng)計(jì)數(shù)相差10%以上時(shí)則重新計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用χ2檢驗(yàn)分析IL-7表達(dá)和臨床病理因素的關(guān)系；生存分析采用Kaplan-Meier法，采用Log-rank檢驗(yàn)判斷差異性。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 IL-7/IL-7R的表達(dá)與NSCLC臨床病理因素的關(guān)系 95例NSCLC組織免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：在正常支氣管上皮、腺體和肺泡上皮細(xì)胞未見(jiàn)IL-7和IL-7R的表達(dá)（圖1A，圖1C）。IL-7主要在癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)（圖1B），按評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，高表達(dá)者占63.16%（60/95），低表達(dá)者或無(wú)表達(dá)者占36.84%（35/95）；IL-7R主要在癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)和胞膜上表達(dá)（圖1D），高表達(dá)者占61.05%（58/95），低表達(dá)者或無(wú)表達(dá)者占38.95%（37/95）。IL-7的表達(dá)水平與IL-7R明顯相關(guān)（r=47.906, P＜0.001）。

對(duì)95例NSCLC組織中IL-7和IL-7R的表達(dá)情況與臨床病理因素進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示：IL-7和IL-7R的表達(dá)與臨床分期（P=0.001； P=0.005）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.001； P＜0.001）均密切相關(guān)，而與患者的年齡、性別、組織分型、分化程度無(wú)明顯關(guān)系（P＞0.05）（表1）。

2.2 IL-7和IL-7R表達(dá)與VEGF-D表達(dá)的關(guān)系 95例人NSCLC免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：在正常支氣管上皮、腺體和肺泡上皮細(xì)胞均未見(jiàn)到VEGF-D的表達(dá)（圖1E），在間質(zhì)的血管、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)有VEGF-D的表達(dá)。VEGF-D主要表達(dá)于癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)（圖1F），按評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，高表達(dá)者占58.95%（56/95），低表達(dá)者或無(wú)表達(dá)者占41.05%（39/95）。IL-7的表達(dá)水平與VEGF-D表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=19.189, P＜0.001）；IL-7R的表達(dá)水平與VEGF-D表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=9.777, P=0.001）。

2.3 IL-7、IL-7R和VEGF-D的表達(dá)與MVD和LVD的關(guān)系 我們分別計(jì)數(shù)IL-7、IL-7R和VEGF-D高表達(dá)組和低表達(dá)或無(wú)表達(dá)組的血管和淋巴管數(shù)目。腫瘤內(nèi)的血管和淋巴管分別用CD34和D2-40抗體標(biāo)記，呈條索或裂隙狀。IL-7高表達(dá)組的LVD明顯高于低表達(dá)或無(wú)表達(dá)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003）；IL-7R高表達(dá)組的LVD明顯高于低表達(dá)或無(wú)表達(dá)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.019）；VEGF-D高表達(dá)組的LVD明顯高于低表達(dá)或無(wú)表達(dá)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（表2）。結(jié)果顯示IL-7、IL-7R和VEGF-D的表達(dá)與NSCLC組織的LVD有關(guān)，而與MVD無(wú)關(guān)聯(lián)（圖2）。

表 1 IL-7和IL-7R蛋白表達(dá)與NSCLC患者臨床因素之間的關(guān)系Tab 1 Relationship between IL-7 and IL-7R expression in NSCLC and clinical pathological factors

表 2 在NSCLC中IL-7、IL-7R和VEGF-D表達(dá)與MVD、LVD的關(guān)系Tab 2 Relationship among the expressions of IL-7, IL-7R and VEGF-D with MVD and LVD in NSCLC

2.4 IL-7、IL-7R和VEGF-D表達(dá)與NSCLC預(yù)后的關(guān)系 對(duì)95例有完整的術(shù)后隨訪記錄的患者進(jìn)行Kaplan-Meier生存曲線分析顯示：IL-7高表達(dá)組患的生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)或無(wú)表達(dá)組者（16±4.487 vs 24±4.982, P=0.008）；IL-7R高表達(dá)組患者的5年生存率明顯低于低表達(dá)或無(wú)表達(dá)組（18±4.152 vs 22±3.649, P=0.032）；VEGF-D高表達(dá)組患者的5年生存率明顯低于低表達(dá)或無(wú)表達(dá)組（16±3.813 vs 23±1.369, P=0.028）（圖3）。

圖 1 在正常肺組織中IL-7（A）、IL-7R（C）和VEGF-D（E）呈陰性表達(dá)，肺癌中IL-7（B）和VEGF-D（F）主要在腫瘤細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，IL-7R主要在腫瘤細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上表達(dá)（D）（SP，×400)。Fig 1 The expressions of IL-7 (A), IL-7R (C) and VEGF-D (E) is negative in normal lung tissue； the expressions of IL-7 (B) and VEGF-D (D) are positive in cytoplasm of lung cancer cells； the expressions of IL-7R is positive in cytoplasm and membrane of lung cancer cell (D) (SP, ×400).

圖 2 NSCLC中IL-7、 IL-7R、VEGF-D的表達(dá)與MVD和LVD之間的關(guān)系。當(dāng)IL-7（A1）、 IL-7R（B1）、VEGF-D（C1）呈高表達(dá)時(shí)相應(yīng)的LVD（E1）也呈高表達(dá)；當(dāng)IL-7（A2）、 IL-7R（B2）、VEGF-D（C2）呈陰性表達(dá)時(shí)相應(yīng)的LVD（E2）也呈低表達(dá)，而MVD（D1、D2）與三者無(wú)關(guān)（SP，×400）。Fig 2 Relationship of the expressions of IL-7, IL-7R, and VEGF-D in NSCLC with MVD and LVD. When the expression levels of IL-7 (A1), IL-7R (B1) and VEGF-D (C1) were high, the corresponding LVD was also high (E1)； However, when the expression levels of IL-7 (A2), IL-7R (B2), and VEGF-D (C2) were low, the corresponding LVD were significantly low (E2), but MVD was not related with the expressions of IL-7, IL-7R, and VEGF-D (SP, ×400).

圖 3 IL-7（A）、IL-7R（B）和VEGF-D（C）陰性表達(dá)組和陽(yáng)性表達(dá)組患者的Kaplan-Meier生存曲線（Log-rank檢驗(yàn)，P=0.008，P=0.032，P=0.028）。Fig 3 Survival of NSCLC patients correlates with the expression of IL-7, IL-7R and VEGF-D. Kaplan-Meier survival plots for patients with NSCLC,grouped according to IL-7 (A), IL-7R (B) and VEGF-D (C) protein expression (Log-rank test, P=0.008, P=0.032, P=0.028).

3 討論

近年研究顯示，一些惡性腫瘤，如：慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞[8]、Burkitt's淋巴瘤細(xì)胞[9]和結(jié)腸癌細(xì)胞[10,12]能產(chǎn)生IL-7；還有一些腫瘤細(xì)胞系，如：食道癌[13]、腎癌[14]、頭頸鱗狀細(xì)胞癌[15]和腮腺Warthin's細(xì)胞系[16]表達(dá)IL-7基因。另外，Al-Rawi[17]研究了乳腺癌組織中IL-7和IL-7R的表達(dá)，結(jié)果顯示在乳腺癌組織中IL-7陰性表達(dá)，而IL-7R表達(dá)陽(yáng)性，且IL-7R表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

IL-7在肺癌組織中表達(dá)如何及其表達(dá)與肺癌轉(zhuǎn)移是否存在相關(guān)性尚未見(jiàn)報(bào)道。為了探討IL-7在肺癌組織中的表達(dá)情況，本研究通過(guò)免疫組化的方法檢測(cè)其在95例有完整隨訪資料的NSCLC以及癌旁組織的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺癌組織中IL-7呈高表達(dá)，在正常支氣管上皮、腺體和肺泡上皮細(xì)胞中不表達(dá)。Al-Rawi[17]研究發(fā)現(xiàn)IL-7在乳腺癌組織中不表達(dá)，這與我們的研究結(jié)果不一致，這可能是組織特異性造成的，而在乳腺癌組織中有IL-7R的表達(dá)，IL-7R的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移到局部淋巴結(jié)有關(guān)，這可能是血液中或其它細(xì)胞分泌的IL-7作用于IL-7R受體后引起的相關(guān)作用。我們發(fā)現(xiàn)在肺癌中IL-7和IL-7R均呈高表達(dá)，且與分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。

隨著腫瘤淋巴管形成相關(guān)分子血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C（vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C）和VEGF-D被發(fā)現(xiàn)，腫瘤淋巴管形成成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。在動(dòng)物模型中，VEGF-C和VEGF-D可以誘導(dǎo)腫瘤淋巴管形成[18,19]。在人膀胱癌、甲狀腺乳頭癌、前列腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、卵巢癌和肺癌[20-28]中VEGF-D高表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。另外，免疫組化結(jié)果顯示在許多腫瘤細(xì)胞中VEGF-D呈高表達(dá)，這說(shuō)明腫瘤細(xì)胞自身可以產(chǎn)生VEGF-D，促進(jìn)腫瘤淋巴管形成[29]。

淋巴轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移是肺癌主要轉(zhuǎn)移途徑，新生血管和淋巴管的形成是腫瘤血行轉(zhuǎn)移和淋巴轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，VEGF-D屬于VEGF家族，與其受體VEGFR-3結(jié)合后可引起淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增生，促進(jìn)淋巴管形成，VEGF-D在腫瘤淋巴管形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。我們同時(shí)檢測(cè)了腫瘤組織周圍MVD和LVD，發(fā)現(xiàn)在肺癌中，淋巴轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移組腫瘤組織周圍LVD和MVD明顯高于非轉(zhuǎn)移組，且IL-7和IL-7R高表達(dá)組腫瘤中的LVD明顯高于低表達(dá)或無(wú)表達(dá)組，而MVD無(wú)明顯差異。

為了進(jìn)一步解釋IL-7高表達(dá)時(shí)LVD數(shù)目增多的現(xiàn)象，我們又檢測(cè)了這些組織中VEGF-D的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF-D與LVD呈正相關(guān)，且IL-7和IL-7R高表達(dá)均與VEGF-D的陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)。Al-Rawi[30,31]研究發(fā)現(xiàn)IL-7可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞系中VEGF-D的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)淋巴管形成。因此我們認(rèn)為在肺癌中IL-7/IL-7R高表達(dá)促進(jìn)VEGF-D高表達(dá)，從而促進(jìn)淋巴管形成。

對(duì)所有具有臨床隨訪資料的患者進(jìn)行生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，IL-7和IL-7R低表達(dá)或無(wú)表達(dá)組的患者的5年生存率明顯高于高表達(dá)組的患者，表明IL-7和IL-7R表達(dá)的上調(diào)可降低患者的生存時(shí)間和生存率。

綜上，在NSCLC組織中，IL-7和IL-7R的表達(dá)水平與VEGF-D表達(dá)、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LVD和預(yù)后不良呈正相關(guān)。