腫瘤分子標志的發(fā)現(xiàn)和驗證：問題和策略探討

李雨晨 宋韋

1 現(xiàn)狀和問題分析

分子標志在腫瘤篩查和診斷、預測療效、復發(fā)、轉(zhuǎn)移及預后方面呈現(xiàn)巨大潛力。同時，許多分子標志本身也是治療腫瘤的藥物靶點。這一認識很大程度歸功于我們對腫瘤在分子水平上認識的極大豐富和高通量芯片新技術(shù)的不斷產(chǎn)生和更新。Hanahan和Weinberg博士[1]在2000年提出腫瘤細胞6大生物學特征：①逃逸凋亡信號；②過度生長信號；③對生長抑制信號不敏感；④復制潛能無限；⑤血管生成持續(xù)；⑥組織侵襲和轉(zhuǎn)移。加之近年來對腫瘤細胞賴于生存的微環(huán)境重要性認識的加強，組成了“腫瘤6+1生物學特征”的新理念。腫瘤分子標志的發(fā)現(xiàn)源于這“6+1生物學特征”，與腫瘤臨床特性密切相關(guān)，成為腫瘤篩查、診斷和病程監(jiān)控的極富潛力的新手段。

于是，早在1996年美國NCI等幾家著名腫瘤研究機構(gòu)牽頭制定了分子標志腫瘤臨床應用價值的評價體系[2]（表1）。按6-檔評分制，根據(jù)分子標志與生物學特征和臨床終止點的相關(guān)性對其是否具有臨床應用價值進行評分。只有得分為++和+++的分子標志才能用于常規(guī)腫瘤的臨床檢測，協(xié)助制定臨床決策，其可能是臨床決策唯一或非唯一的標準。

2000年，美國臨床腫瘤協(xié)會（American Society of Clinical Oncology, ASCO）腫瘤標志專家組更新了1997年推薦的分子標志用于結(jié)直腸癌和乳腺癌臨床實踐的指南，但推薦更新的內(nèi)容與1997年相比無明顯差異[3]。CEA、CA-199、p53和Ras基因雖然用于結(jié)直腸癌檢測，但由于特異性和敏感度低等原因仍不推薦用于篩查和診斷分期。CEA僅推薦用于治療前后每2-3個月跟蹤監(jiān)測結(jié)直腸癌的進展情況。用于乳腺癌的腫瘤標志主要是雌激素受體（estrogen receptor, ER）、孕激素受體（progestogerone receptor, PR）和HER-2/neu。對停經(jīng)前后的患者，推薦檢測ER和PR用以挑選最可能對激素類輔助治療敏感和治療復發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者。檢測HER-2/neu基因擴增或表達可用于挑選對曲妥珠單抗（Herceptin）有效的轉(zhuǎn)移、復發(fā)或手術(shù)無法切除的局部晚期患者。

然而，10年已經(jīng)過去。與2000年相比，至今應用于腫瘤臨床的分子標志仍寥寥無幾。為什么20年的腫瘤標志研究和數(shù)百篇的研究報道（尤其是近10年）沒有產(chǎn)生更加理想的結(jié)果？這可能很大程度歸咎于我們研究報道的實驗結(jié)果在前瞻性臨床試驗驗證中難以重復。

首先，在分子標志的發(fā)現(xiàn)和驗證階段存在問題。研究方法、實驗設(shè)計、檢測手段、樣本和數(shù)據(jù)收集和處理、統(tǒng)計分析方法等方面存在任何的不合理性都可能影響實驗結(jié)果。CEA是典型例子，反映了樣本收集標準不一致帶來的后果：1969年P(guān)NAS的文章[4]報道CEA用來篩查結(jié)直腸癌的敏感性和特異性接近100%。隨后在10年的應用中發(fā)現(xiàn)，CEA篩查結(jié)直腸癌的敏感性和特異性遠遠不如最初報道的結(jié)果。1978年NEJM的文章[5]分析其原因主要在于發(fā)現(xiàn)和驗證時采用的腫瘤樣本惡性程度高，而隨后用于篩查時，面對的大多是無癥狀或早期腫瘤。

2 共識和策略探討

據(jù)此，國際腫瘤研究和臨床學界對分子標志在發(fā)現(xiàn)和驗證階段存在的問題展開討論，達成共識，以引導和規(guī)范化腫瘤分子標志發(fā)現(xiàn)和驗證的研究[6,7]。

2.1 發(fā)現(xiàn)階段存在的主要問題 （1）患者選擇標準不統(tǒng)一（如：切除程度、是否輔助治療）；（2）樣本收集和處理不一致（如：快速冷凍或方便獲得的組織）；（3）多因素分析漏掉NCCN指南的多項臨床風險因子、未比較它們之間優(yōu)劣勢（如：切除程度、腫瘤大小）；（4）未做亞級分析或樣本小量，分析結(jié)果不準，難以與臨床指標聯(lián)合使用，提高預測力；（5）建立預測模型細節(jié)不詳（如：權(quán)重和閾值）或漏掉臨床指標（如：腫瘤大小）；（6）標志物模型能預測的一組患者，臨床指標也能預測，不呈現(xiàn)優(yōu)勢；（7）忽略重要臨床需求（如：挑選出IA級需要化療的高復發(fā)風險的患者、IB級和II級不需要化療的低復發(fā)風險的患者）。

2.2 驗證階段存在的主要問題

2.2.1 體制問題 （1） 評價診斷和預后分子標志的體系和規(guī)則遠不如評價治療方案的體系和規(guī)則完善。評估治療方案采用實驗性方法，如隨機對照臨床試驗，能有效地處理異源性、復雜性和偏見性等對結(jié)果驗證的威脅；而評價診斷和預后采用觀察或臨床流行學的非實驗性方法，且驗證程序粗糙。（2）FDA等監(jiān)督管理部門對藥物研發(fā)和市場的監(jiān)督力度也促進評價治療方案的規(guī)章的完善，而對診斷和預后研究卻沒有相關(guān)監(jiān)督管理部門。

2.2.2 方法問題 （1） 驗證方法多樣，如隨機取樣驗證、樣本分割驗證及樣本分割交叉驗證（如：留一交叉驗證法）；（2） 驗證集樣本小（＜50）或樣本大但異源性太高，與訓練集差異太大；（3） 獨立驗證僅占研究報道的10%，更缺乏“外來樣本”的獨立驗證；（4） 多個標志在小樣本中發(fā)現(xiàn)和驗證，造成統(tǒng)計學上的Overfit現(xiàn)象。

表 1 腫瘤標志臨床應用評分細則

3 針對腫瘤標志研究的建議性指南

針對這些問題，美國NCI等相關(guān)專家提出針對腫瘤標志研究的建議性指南[6]，主要包括：（1）明確研究目的，尤其是臨床研究目的；（2）對數(shù)據(jù)收集和報道，要求：①謹慎地設(shè)計患者入組和排除標準及樣本量，②準確報道患者治療方案和所有常規(guī)臨床指標，③詳細描述樣本收集方法和實驗手段，④公布所有原始實驗數(shù)據(jù)；（3）統(tǒng)計分析和結(jié)果報道，要求：①詳細描述統(tǒng)計方法， 包括數(shù)據(jù)標準化方法、數(shù)據(jù)過濾方法、變量選擇、建模技術(shù)、丟失數(shù)據(jù)處理、閾值選擇及其合理性，②終止點是死亡或復發(fā)時間，數(shù)據(jù)處理不應該進行二進制變換，③結(jié)果至少在一組完全獨立的樣本中驗證，④證明標志物的臨床應用價值；（4）詳細描述預測模型的建立，以便其他研究者可以用獨立樣本驗證模型；（5）與現(xiàn)有手段比較，明確提出新結(jié)果的優(yōu)勢及局限性。

此次，研究結(jié)果的報道方式也存在問題。報道方式不嚴密、不統(tǒng)一，導致難以有效地評價、比較和驗證研究質(zhì)量和研究結(jié)果。為此，NCI-EORTC對標志物研究（尤其預后標志研究）的論文提出審稿標準20條的建議，其目的是便于評價研究設(shè)計、方法和結(jié)果分析，提高不同來源的研究結(jié)果間的可比性，增強研究透明性和研究工作的完整報道[8]。表2列出審稿標準20條建議。

表 2 腫瘤標志研究審稿標準20條建議[8]

4 結(jié)語

至今，分子標志在臨床應用最成功的方面應該是用于指導個體化靶向治療。如：檢測Her2/neu基因擴增或表達，用于指導挑選對靶向藥曲妥珠單抗敏感的乳腺癌患者，EGFR/k-Ras突變檢測指導挑選對吉非替尼（Iressa）和厄洛替尼（Tarceva）敏感的肺癌和結(jié)直腸癌患者。希望未來的10年，在更加嚴謹?shù)膶嶒炘O(shè)計、實驗操作和完善的評價機制引導下，更多有潛力的分子標志被推向臨床應用。