小麥籽粒多酚氧化酶活性變化研究

陳 軍，高貴珍，曹穩根，馬傳喜

（1.宿州學院化學與生命科學系，安徽宿州234000；2.安徽農業大學農學院，安徽合肥230036）

小麥生產在我國國民經濟中占有重要地位，其中面制食品是我國人民的主食之一。而在面制食品的加工和儲藏過程中經常會出現褐變現象。有不少研究表明，小麥中多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO）是影響褐變的主要原因[1～3]。

PPO是一類廣泛分布于植物體內能催化多酚類氧化成醌類的質體金屬酶，它的底物（酚類物質）存在于液泡中，且這種酶與底物的區域分布使得PPO在完整細胞內的生理功能難以確定。生物體內的PPO分布是不均勻的，具有時間和空間特異性。在小麥中，從幼苗到植株以及成熟籽粒中都含有多酚氧化酶，但種類及活性有所差異。一些研究表明，小麥籽粒中的PPO主要存在于麩皮層中，面粉中PPO活性隨著出粉率的增加而提高[4]，且不同小麥類型和品種間PPO均有一定差異；對同一品種而言，發育成熟的大籽粒PPO高于發育不完全的小籽粒。硬粒小麥多酚氧化酶活性最低，普通白粒小麥多酚氧化酶活性低于硬紅冬、硬紅春及軟紅冬小麥，但是硬紅冬和軟紅冬小麥、硬紅冬和硬紅春小麥間多酚氧化酶活性差異較小[5]。大量研究表明，成熟籽粒PPO主要存在于種皮中，胚中無PPO[6，7]，但小麥籽粒發育及萌發過程中PPO動態性的變化規律還不是很清楚。

本研究選取不同類型小麥品種，對籽粒發育及萌發過程中PPO活性進行研究，以期找出小麥籽粒PPO活性變化規律，為小麥PPO遺傳改良提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

發育期供試材料為：安農95081-8、安農95083-6-1、安農 0309、鄭麥 9023、安農 9267 和煙農19 6個品種，于2006—2007年種植于安徽農業大學試驗田。

萌發期供試材料為：宿麥553、徐麥856、皖麥 50、皖麥 52、煙農 19、邯 6172、連麥 2號 7個品種，于2007—2008年種植于宿州市農科所試驗田。

以上材料均采用小區撒播種植，田間管理與大田一致。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理

1.2.1.1 發育期籽粒的處理 各品種在盛花期選取同時開花且大小一致的200穗掛牌標記。4月28日第1次取樣，每品種分別取15穗放于冷凍冰箱（-70℃）中待測。以后每隔5 d取樣1次，直至成熟收獲。

1.2.1.2 萌發期籽粒的處理 （1）每個品種稱取相同質量的籽粒21份，每份1.000 g。（2）將上述樣品浸于一個培養皿里，于25℃、空氣濕度95%的人工可編程氣候箱內培養，且要定時翻動籽粒。（3）萌發期分 7 個階段取樣，即 0，12，24，36，48，60，72 h（每隔 12 h取樣1次）。將培養好的小麥籽粒冰浴研碎備用。

1.2.2 PPO活性檢測方法

1.2.2.1 發育期籽粒PPO活性檢測 參照Anderson[8]和Morris[9]的方法。未成熟籽粒（干質量為0.300 0 g）放于研缽中冰浴研碎后轉入50 mL小燒杯中；成熟籽粒用瑞典產旋風磨制備全麥粉（過0.5 mm篩）。稱取0.300 0 g全麥粉放入50 mL小燒杯中，加入7.5 mL反應試劑（50 mmol/L，pH=6.5的MOPS緩沖液；10 mmol/L L-DOPA，左旋多巴作為PPO反應底物），恒溫水浴振蕩器上振蕩5 min（振蕩器速度設為100 r/min，溫度設為37℃），樣品充分暴露在空氣中，之后迅速將反應后的樣品放在冰塊上終止反應（1 min），并迅速混勻樣品，用中速定量濾紙進行過濾。以反應試劑（空白L-DOPA/MOPS，左旋多巴與MOPS的混合液）為對照，在475 nm下測定濾液的吸光度ΔA（ΔA為5 min內吸光值的變化），每克籽粒每分鐘吸光值上升0.001定義為一個酶活單位（單位AU，absorbance unit）。PPO的活性表示為ΔA×103AU/（min·g）。

1.2.2.2 萌發期籽粒PPO活性檢測 在比色皿中依次加入2.8 mL磷酸緩沖液，1 mL 0.1 mol/L鄰苯二酚。用移液管加入0.3 mL粗酶液，混勻，迅速放入37℃水浴鍋中，水浴5 min后測OD420。每克籽粒每分鐘吸光值上升0.001定義為一個酶活單位（單位 AU，absorbance unit）。PPO的活性表示為ΔA×103AU/（min·g）。

1.3 數據分析

運用Excel和SAS統計分析程序對數據進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 PPO活性變異方差分析

由表1可知，基因型與發育時期互作PPO活性變異的方差分析中，籽粒發育的不同階段PPO活性差異極顯著，不同基因型和基因型與發育時期互作PPO活性差異都不顯著。因此，基因型對籽粒發育過程中PPO活性不具有顯著影響，基因型與發育時期互作對PPO活性也不具有顯著影響，而籽粒發育的不同階段對PPO活性有顯著影響，且發育時期間的PPO活性差異遠大于品種間的差異。這表明籽粒發育的不同時期是影響PPO活性的主要因素。

表1 基因型與發育時期互作PPO活性變異的方差分析

從不同品種與萌發期互作PPO活性變異方差分析（表2）可看出，品種間PPO活性差異極顯著，不同萌發階段PPO活性差異也達到極顯著水平，而品種與萌發期互作PPO活性差異不顯著。這表明在小麥籽粒萌發過程中，品種和萌發期對PPO活性都有顯著影響。

表2 基因型與萌發期互作PPO活性變異方差分析

2.2 PPO活性的變化

圖1結果表明，籽粒發育過程PPO活性變化大致趨勢是先降低后升高，但品種間變化幅度不同。安農95083-6-1和安農0309 2個品種開始時PPO活性較高然后大幅度下降，下降后又漸漸升高；安農95081-8、安農9267、煙農19和鄭麥9023這4個品種PPO活性的變化趨勢較為平緩。

由圖2可知，各品種PPO活性的變化趨勢和幅度不盡相同，宿麥553變化幅度較小，其余6個品種變化幅度較大；徐麥856 PPO活性變化呈先升高后降低的趨勢；連麥2號、邯鄲6172、皖麥52 3個品種PPO活性呈升高后降低接著再升高又降低的變化。這說明小麥籽粒萌發過程中PPO活性是不穩定的，但小麥籽粒萌發過程中成熟干籽粒（0 h）PPO活性最低。

3 結論與討論

小麥籽粒發育及萌發過程中PPO活性呈動態變化趨勢，存在著極其復雜的表達調控機制。通過對不同品種PPO活性的研究，不同發育期間的PPO活性差異遠大于品種間的差異，籽粒發育過程中不同品種的不同發育時期間PPO活性變異水平不同，其PPO活性變化是開始時較高然后降低接著又升高，不同品種間這種變化幅度不同，一些品種變化幅度較大；萌發過程中PPO活性也是不穩定的，各品種PPO活性的變化趨勢和幅度不盡相同，在小麥籽粒萌發過程中品種和萌發期對PPO活性都有顯著影響。現已知道PPO是一種質體酶，存在于葉綠體、白色體等質體中，生理狀態下與底物嚴格隔離[10]，但在小麥籽粒萌發過程中，PPO易于釋放進而與底物接觸，這可能會導致萌發過程PPO活性較高。

一些研究發現，在植物組織或器官中，幼嫩部位的PPO活性較高，而成熟或衰老部位的PPO活性低，但PPO的生理功能還不清楚[11，12]。由于PPO主要位于正常細胞的質體中，其作為氧化還原酶被認為與呼吸鏈末端電子傳遞有關，能消除氧自由基的傷害與催化植物或動物的色素形成[13，14]。小麥植株PPO活性因感染病蟲而升高，因此PPO可能與植物自身防御功能有關，但缺乏直接的證據。此外，PPO與植物的生長發育可能有關，可促進乙烯的代謝。因此，本研究所得結果的原因可能有2個方面：一是籽粒本身抗性的需要，二是不同品種的小麥表達PPO的水平不同。

大量研究表明，PPO與植物抗病性密切相關，PPO活性升高是小麥抵抗病原侵入和擴展的一種保護反應。然而面制食品需要的是低PPO活性的小麥，以減輕面制食品的褐變，因而，在選育品種時，應選擇籽粒發育期PPO活性高成熟后PPO活性低的品種。至于小麥籽粒發育和萌發期PPO活性變化是否存在內在關系，這還有待于進一步研究。但本研究得出的籽粒發育的不同時期是影響PPO活性的主要因素，籽粒萌發過程中品種和萌發期對PPO活性都有顯著影響，這一結論可為小麥品質改良提供重要信息。

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