HL-60細胞培養上清液對人臍帶血單個核細胞增殖的影響

鄭 毅 ，陳代雄

（1.遵義醫學院附屬醫院貴州省重點細胞工程實驗室,貴州遵義563000；2.遵義醫藥高等專科學校 生理教研室，貴州 遵義563000）

1 材料與方法

1.1 HL-60細胞株 HL-60細胞源自人骨髓細胞的白血病細胞,購于中國科學院細胞庫通過常規傳代，凍存保護。

1.2 臍帶血的來源 經知情同意后，無菌采集足月分娩臍血3例（肝素抗凝），每份50ml,采集后2h內進入實驗程序。

1.3 主要試劑 本試驗所用主要試劑見表1。

表1 主要試劑Tab 1 Main reagents

1.4 人臍帶血MNCs分離 用PBS按1:1(V/V)比例稀釋臍帶血,按1:4(V/V)比例加入6%HES混勻,靜止45min待沉降紅細胞,出現清晰界面后吸取上清按1:3(V/V)比例用PBS稀釋,1500rpm離心10min,細胞沉淀用PBS懸浮后，吸細胞懸液沿管壁緩慢注入到Ficoll淋巴細胞分離液(比重1.077)面上,1800rpm離心20min,吸取白膜層用PBS洗1次,沉淀用PBS懸浮,此即臍帶血MNCs懸液。常規細胞計數。

1.5 HL-60細胞培養上清液的制備 復蘇HL-60細胞后用PBS洗2次,沉淀用RPMI-1640(20%FBS)懸浮,以5.00×105/ml的細胞密度接種于培養瓶,置37℃，5%CO2飽和濕度環境下培養。培養第3天收集細胞,1500rpm離心15min,收集上清經0.22μm濾膜過濾。過濾液經鏡檢不含HL-60細胞。

1.6 臍帶血MNCs的體外擴增 擴增培養設有6個實驗組:①HL-60細胞培養上清液+StemSpan誖SFEM;②StemSpan誖SFEM;③HL-60 細胞培養上清液+HG-DMEM;④HG-DMEM;⑤HL-60 細胞培養上清液+LG-DMEM;⑥LG-DMEM,各組培養液中均含有10%的FBS。將分離的臍帶血MNCs以5.0×105/ml的密度(即每瓶細胞總數為2.50×106)分別接種入上述6組不同的培養體系中,置37℃，5%CO2，飽和濕度環境下培養。培養第4天各組用相應的培養液半量換液,以后每隔1天半量換液。

1.7 臍帶血MNCs體外擴增效果的檢測 各組分別于第3,6,9,12天在倒置顯微鏡下觀察細胞的增殖情況,并進行細胞計數(細胞總數),繪制增殖曲線。

1.8 統計學分析 所有實驗數據采用統計軟件SPSS For Windows 12.0進行處理。如果方差齊，采用t檢驗;如果方差不齊,則采用t’檢驗.樣本數據以均數±標準差(x±SD)表示。P<0.05表示差異有顯著性意義，P<0.01表示差異有非常顯著性意義。

2 結果

不同培養體系對人臍帶血MNCs增殖動力學的影響：從表2和圖1可知，至第3d,HL-60細胞培養上清液+StemSpan誖SFEM和StemSpan誖SFEM組的MNCs數均明顯升高,第9d仍處于較高水平;而其余4組的MNCs隨培養時間推移呈逐漸下降,其中以未加HL-60細胞培養上清液的HG-DMEM和LGDMEM組下降尤為明顯;HL-60上清液+StemSpan誖SFEM和StemSpan誖SFEM組在各個時間上的MNCs數均無明顯差異（P>0.05）,但添加HL-60上清的高糖組和低糖組各時點MNCs數均高于相應的對照組(均 P<0.05)。

HL-60細胞培養上清液高糖組各時間點MNCs數明顯高于高糖組 (P<0.05)(見圖2）；HL-60細胞培養上清液低糖組各時間點MNCs數也明顯高于低糖組(P<0.05)(見圖 3)。

表2 不同培養體系對人臍帶血MNCs增殖動力學的影響Tab 2 Effect of various cultural system on proliferation of MNCs from UCB(x±SD，n=3)

圖2 H+HG和HG培養中人MNCs數變化的比較H+HG:HL-60細胞培養上清液+HG-DMEM;HG:HGDMEM;*與HG比較P<0.05Fig.2 comparison of number of MNCs cultured with H+HG and HG respectively

圖3 H+LG和LG培養中MNCs數變化的比較H+LG:HL-60細胞培養上清液+LG-DMEM;LG:LGDMEM;*與LG比較P<0.05Fig.3 comparison of number of MNCs cultured with H+LG and LG respectively

3 討論

目前，通常采用SCF,EPO,FL,IL-1,IL-3,IL-6細胞因子組合方案進行臍帶血MNCs的體外擴增，在缺乏細胞因子的培養體系中，臍帶血MNCs隨時間延長則逐漸減少。結果表明,SFEM組和添加HL-60上清SFEM組隨培養時間推移,MNCs均明顯升高,至第9天仍可維持在較高水平。盡管添加HL-60上清SFEM組與SFEM組相比,培養后MNCs無明顯增加,但添加HL-60上清的其余實驗組均較相應對照組的MNCs數明顯升高,說明HL-60細胞培養上清液對MNCs具有一定的增殖作用。實驗結果還表明,StemSpan誖SFEM作為MNCs擴增的基礎培養基優于HG-DMEM和LG-DMEM，比較適合于MNCs的體外擴增。

許多研究證明，急性白血病細胞能分泌細胞生長因子，如 GM-CSF[1,2]，IL-6[3]，IGF-Ⅰ[4]等，本實驗所顯示的HL-60上清對MNCs的增殖作用可能與HL-60細胞分泌此類細胞因子有關。

實驗首次證明HL-60細胞培養上清液對人臍帶血MNCs具有一定的促進增殖作用,這可能與HL-60細胞培養上清液存在促進細胞增殖的細胞因子有關。

[1]Young Diane C,Griffin James D.Autocrine Secretion of GMCSF in Acute Myeloblastic Leukemia[J].Blood,1986，68:1178-1181

[2]樊娟，徐功立，王春霞，等.急性髓性白血病細胞自分泌造血生長因子水平及其臨床意義 [J].中國免疫學雜志，2000，5：283-285

[3]H Sugiyama,K Inoue,H Ogawa,et al.The expression of IL-6 and its related genes in acute leukemia[J].Leuk Lymphoma,1996，21(1-2):49-52

[4]Estrov Zeev,Meir Roza,Barak Yigal,et al.Human Growth Hormone and Insulin-like Growth Factor-1 Enhance the Proliferation of Human Leukemic Blasts [J].Journal of Clinical Oncology,1991，9(3):394-399.