染錳大鼠血清和睪丸LDH活性的變化

才秀蓮，郭海，伍冬梅

（遵義醫學院，貴州 遵義 563000）

精子發生經歷精原細胞的增殖、精母細胞的減數分裂和精子形成3個階段。每個階段的正常進行都需要足夠的能量供應。在生精過程中，生精細胞對有害的環境化學物質非常敏感[1]。LDH是生精細胞能量代謝的重要酶系，主要由LDH催化丙酮酸轉化為乳酸，通過糖酵解生能提供能量。隨著工業現代化的發展，錳的生產和消費日益增多，特別是甲基環戊二烯羰基錳（MTT）取代四乙基鉛作為汽油抗爆劑的廣泛使用，汽油用量和尾氣排放不斷增加，導致環境中錳含量升高。近年來在生殖醫學日益發展的引導下，錳對人體健康的危害開始受到關注[2，3]，但有關錳的男/雄性生殖毒性的機理尚未明確，為此本文進行研究，為預防、早期診治錳中毒誘發的男/雄性生殖疾病和環境毒物安全接觸限量的制定等提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 LEICA RM 2245型切片機（德國LEICA公司）；HITACHI U-3010型全自動生化分析儀（日本HITACHI公司）；721型可見光分光光度計（山東高密分析儀器廠）；FSH-2型可調式高速內切式組織勻漿機（上海浦東物理光學儀器廠）;MnCl24H2O購自中國醫藥集團上海化學試劑公司；乳酸脫氫酶（LDH）測試試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠48只，體重110~130g，由第三軍醫大學動物中心提供，飼養溫度18～25℃，濕度60%～70%，合格證號：SCXK-(軍)20020008。適應性喂養1wk后實驗。隨機分為6組：15，30mg/kg染錳組和對照組，每組8只。染錳組大鼠分別經腹腔注射MnCl2·4H2O 15和30mg/kg，對照組給予等容生理鹽水，每天1次，每周5天，每周測大鼠體重，調整用錳量。分別染錳4wk和6wk處死大鼠并收集血清和睪丸。

1.3 化學比色法測定睪丸及血清LDH活性 制備1%睪丸組織勻漿：取出待測標本，復溫至室溫，濾紙吸干水分，準確稱取其重量，剪碎，生理鹽水定容至1%，制備組織勻漿，3000rpm離心10min，取上清液分裝。LDH測定：分別取未稀釋血清20μl和1%睪丸勻漿150 μl用于測定血清和睪丸組織LDH含量，具體操作步驟按試劑盒說明書進行，測定440nm波長的OD值。

2 結果

2.1 血清與睪丸LDH活性檢測結果 與空白對照組比較，染錳6wk 30mg/kgMnCl2組血清LDH活性顯著升高（P<0.01）;染錳 4wk 30mg/kg MnCl2組，6wk 15mg/kg MnCl2組，6w 30mg/kg MnCl2組睪丸LDH活性均降低（P<0.01）。染錳時間相同，染錳6wk 30mg/kg MnCl2組與15mg/kg MnCl2組相比較，血清LDH活性顯著升高（P<0.01），染錳4wk和染錳6wk，30mg/kg MnCl2組與15mg/kg MnCl2組相比較，睪丸LDH活性均降低（P<0.05）。染錳劑量相同，染錳6wk組與染錳4wk組相比較，血清LDH活性顯著升高（P<0.01），睪丸 LDH 活性均顯著降低（P<0.01）（表 1）。

2.2 睪丸LDH活性與血清LDH活性的相關關系睪丸LDH活性與血清LDH活性呈負相關，相關系數 r=-0.164,P<0.05（圖 1）。

圖1 各組大鼠血清LDH活性與睪丸LDH活性直線相關圖

表1 染錳劑量與時間對大鼠血清和睪丸LDH活性的影響（U/L,U/g蛋白,±s）

表1 染錳劑量與時間對大鼠血清和睪丸LDH活性的影響（U/L,U/g蛋白,±s）

與空白對照組比較aP<0.05，aaP<0.01；染錳時間相同，30mg/kg MnCl2組與15mg/kg MnCl2組比較 bP<0.05，bbP<0.01；染錳劑量相同，染錳6wk組與染錳4wk組比較cP<0.05，ccP<0.0

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3 討論

LDH是組織細胞質的標志酶之一，廣泛存在于人體組織中，以心肌、骨骼肌、腎臟和肝臟含量最豐富[4，5]。是衡量機體無氧代謝能力的重要指標。正常人血清LDH比組織細胞中低1000倍，少量的組織細胞壞死即可釋出，使血清LDH活性升高。血清LDH活性水平可反映富含LDH細胞的生物學性狀。LDH-x是LDH同工酶，在具有減數分裂的生精細胞和單倍體的精子細胞中表達[6]，其活性占LDH總活性的46.3%[7]。 LDH催化丙酮酸和乳酸的轉化反應，通過糖酵解生能，為生精細胞的生長發育成熟提供能量，對男/雄性生精功能及精子活動起重要作用。因此，測定血清和睪丸的LDH活性，有助于探討富含LDH的組織細胞及睪丸是否受到損害和損害程度。錳是機體必須的微量元素之一，但攝入過量錳會對機體產生毒害作用[8,9]。錳作為一種環境污染物和職業危害因素，人們確對其研究不如鉛和鎘等深入。特別是鋼鐵及汽車工業的發展，環境中的錳含量迅速增加，對人體可造成潛在危害。本研究發現染錳30 mg/kg 6wk可誘發血清LDH活性升高（P<0.01），15mg/kg 6wk可使大鼠睪丸LDH活性受到抑制，僅為2439.25U/克蛋白（P<0.01），一方面證實過量錳可干擾生精過程中的能量合成，抑制睪丸LDH活性，而另一方面證實了過量錳具有穿透睪丸白膜，滲透到睪丸內部，對生精小管產生直接的破壞作用。在睪丸LDH活性受到抑制同時，血清內LDH活性反而上升，二者呈負相關(r=-0.164,P﹤0.05)，這一方面表明過量錳破壞了生精細胞的細胞膜，導致LDH流失到血清中，另一方面，LDH升高可能是錳中毒造成的機體富含LDH的組織器官，如心臟、骨骼肌、腎和肝等損傷后，導致這些器官組織細胞破壞，LDH逸入血清所致，提示過量錳可能對心肌、骨骼肌、腎和肝等具有毒性效應。

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