煙霧暴露所致肺氣腫小鼠模型的建立與評價

曹君，陳平，楊悅，歐陽若蕓，彭紅

(中南大學湘雅二醫(yī)院呼吸內科，長沙 410011)

研究報告

煙霧暴露所致肺氣腫小鼠模型的建立與評價

曹君，陳平，楊悅，歐陽若蕓，彭紅

(中南大學湘雅二醫(yī)院呼吸內科，長沙 410011)

目的探討單純煙霧暴露所致肺氣腫小鼠模型建立及病理學、氣道炎癥及肺功能評價，并進行支氣管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage，BAL)技術的改進。方法20只C57BL/6J小鼠隨機分為正常對照及煙霧暴露組，煙霧暴露90 d并觀察30 d后行小鼠肺功能檢查、應用改進方法留取BALF行細胞計數(shù)及行肺組織病理切片觀察，并與正常對照組進行比較。結果煙霧暴露組小鼠氣道阻力(Raw)較正常對照組增高，動態(tài)肺順應性(Cdyn)降低;BALF中細胞總數(shù)高于正常對照組，巨噬細胞數(shù)(AM)、中性粒細胞數(shù)(N)、中性粒細胞所占比例(N%)也高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義;病理學觀察示煙霧暴露組肺泡腔擴大、部分肺泡間隔斷裂、肺泡腔融合、肺氣腫形成，氣道上皮排列紊亂、部分氣道上皮增生、周圍炎癥細胞浸潤并伴有平滑肌增生;形態(tài)學計量分析示煙霧暴露組平均內襯間隔(MLI)及肺泡破壞指數(shù)(DI)較正常對照組增加。應用改進技術行BAL成功率100%，回收率高達90%。結論單純煙霧暴露可以成功建立小鼠肺氣腫模型且穩(wěn)定可靠，與人類慢性阻塞性肺病相似性好，經(jīng)BAL技術改進后該模型可行性高。

慢性阻塞性肺疾病;肺氣腫;香煙煙霧;動物模型;支氣管肺泡灌洗

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)由于其患病人數(shù)多，死亡率高，社會經(jīng)濟負擔重，已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題［1］。阻塞性肺氣腫(簡稱肺氣腫)是COPD的主要病理表現(xiàn)。COPD是一種慢性進展性疾病，對人體進行直接研究無論是在技術上還是在道德倫理上均受限，故動物模型的建立及研究顯得十分重要。目前國內已有多人采用單純煙霧暴露成功復制肺氣腫大鼠模型［2，3］，而關于小鼠肺氣腫模型建立研究很少，但國外小鼠肺氣腫模型應用廣泛，考慮小鼠個體小、干預及取材等操作存在難度限制其在國內研究中推廣。小鼠有易于飼養(yǎng)，繁殖能力強及實驗費用低等優(yōu)點;且與人類同源性高，是一種很好的研究人類疾病的動物模型。支氣管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage，BAL)是COPD動物模型研究中重要部分，獲取的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)可通過計數(shù)炎癥細胞、檢測細胞因子水平等反映肺局部病理及生理變化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器

芙蓉牌香煙(焦油13毫克/支，湖南中煙工業(yè)有限責任公司)，Carl Zeiss Axioskop 40光學顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)，靜脈留置針(直型，22G，威海潔瑞醫(yī)用制品有限公司)，PLY3211小動物肺功能檢測系統(tǒng)(美國Buxco Electronics公司)。

1.2 動物分組

6周齡SPF級近交系C57BL/6J雄性小鼠20只，體重18～20 g，來源于中國科學院上海實驗動物中心【SCXK(滬)2007－0005】，于中南大學湘雅二醫(yī)院實驗動物中心清潔房飼養(yǎng)，溫度21～23℃，濕度50%～60%，晝夜12 h節(jié)律，自由進食、飲水。小鼠隨機分為正常對照組及煙霧暴露組，每組10只。實驗過程中按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.3 肺氣腫模型建立

小鼠適應性飼養(yǎng)兩周后開始造模。采用自制的有機玻璃箱(69 cm×47 cm×38 cm)，玻璃箱1/2高度處置有機玻璃隔板(隔板上有直徑1 cm圓形通風孔，排布密度:1個/6 cm2)將玻璃箱分為上下兩部分，有機玻璃箱頂及四側面下1/2均有圓形通氣孔(箱頂:1個/100 cm2;側面下1/2:1個/250 cm2)。將10只C57BL/6J小鼠置于隔板上，于玻璃箱下1/ 2空間內點燃6只香煙，至香煙燃燒完全、煙霧基本消失，約15 m in;掀開箱蓋，休息5 m in，重復一次煙霧暴露。每日兩次上述煙霧暴露，連續(xù)90 d，停止煙霧暴露后觀察30 d。正常對照組小鼠亦同時放入另一自制有機玻璃箱中，呼吸空氣。為初步觀察煙霧暴露過程中肺病理變化，在煙霧暴露過程中第30天及90 d分別隨機抽取正常對照及煙霧暴露組各一只小鼠行肺病理檢查。

1.4 小鼠肺功能檢測

煙霧暴露停止30 d，10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔麻醉小鼠，固定，備皮、消毒后，剪開皮膚，輕柔鈍性分離暴露氣管，在氣管軟骨環(huán)之間水平剪開氣管，插入導管并連接小動物肺功能儀進行肺功能測定，記錄氣道阻力(Raw)、動態(tài)肺順應性(Cdyn)及呼氣峰流速(PEF)等指標。描記一段平靜呼吸后，于呼氣末自接口處快速注入1.0 m L空氣，使小鼠被動的深吸氣，記錄數(shù)據(jù)。小鼠肺功能檢測在中南大學湘雅醫(yī)學院機能實驗中心進行，為保證肺功能數(shù)據(jù)質量，操作均由同一人進行。

1.5 支氣管肺泡灌洗液的收集及計數(shù)

肺功能測定后頸椎脫臼處死小鼠，打開左側胸腔，沿肺葉向上分離結扎左主支氣管;自氣管切開處置入22G靜脈留置針套管并結扎氣管，靜脈留置針尾接1m L注射器針筒，較快速度注入無菌PBS 0.5 m L行單側BAL，注入PBS后立即緩慢低負壓回收液體，重復灌洗三次，回收率90%～92%。收集的BALF混勻后吸取20 μL于血細胞計數(shù)器上行細胞計數(shù);余BALF于4℃1000 r/m in分離心10 min，取沉淀重懸于PBS液并制作3張細胞涂片，W right－Giemsa染色作細胞分類計數(shù)。

1.6 小鼠肺組織病理學觀察及形態(tài)定量分析

結扎右側主支氣管及左上肺支氣管并注入4%多聚甲醛至左下肺膨脹，隨后將左下肺浸入4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋、4 μm連續(xù)切片，常規(guī)蘇木素－伊紅(HE)染色，光學顯微鏡觀察HE染色。平均內襯間隔(mean linear intercept，MLI)測定:每只小鼠取3個HE染色切片，低倍鏡(×100)下隨機取5個視野(避開大血管和支氣管)，在每個視野正中心劃十字交叉線，計數(shù)與交叉線相交的肺泡隔數(shù)(NS)，同時測出十字線總長(L)，按公式計算:MLI=L/NS，以表示肺泡平均內徑。肺泡破壞指數(shù)(Destructive index，DI)的測定參照陳燕等［4］方法進行:每只小鼠取3個HE染色切片，每張切片低倍鏡(×100)下至少觀察20個非重復視野，分別以正常(N)或破壞(D)記錄肺泡結構的破壞情況，要求每一例各切片的N、D值總和≥3000，以公式計算DI=D/(D+N)×100。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 小鼠一般情況觀察

兩組小鼠在實驗前外觀、對刺激的反應及體重均無明顯差異。實驗中煙霧暴露組小鼠在早期表現(xiàn)燥狂不安，隨煙霧暴露時間延長而轉為安靜。在煙霧暴露后期，小鼠出現(xiàn)進食減少，行動遲緩，毛發(fā)干澀無光澤。煙霧暴露過程中無小鼠死亡。正常對照組小鼠飲食正常，活動靈敏，皮毛有光澤。

A:正常對照組B:煙霧暴露組C:肺功能流量－時間曲線圖解圖1小鼠肺功能流量－時間曲線(flow－time curve)變化A.Control group B.CS－exposed group C.Explanation of flow－time curve Fig.1 Flow－time curve of pulmonary function in mice

2.2 小鼠肺功能檢測

肺功能流量－時間曲線(圖1－C)下半部分為吸氣相，上半部分為呼氣相。與正常對照組相比(圖1－A)，煙霧暴露組(圖1－B)流量－時間曲線的上半部分上升支較陡直、而下降支斜度較小且伴有頓挫，呼氣相延長。煙霧暴露組小鼠Raw較正常對照組增高明顯，Cdyn較正常對照組低，差異均有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05);煙霧暴露組呼氣峰流速(PEF)較正常對照組稍低，但差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 兩組小鼠肺功能結果比較(±s，n=8)Tab.1 Comparison of pulmonary function between CS－exposed group and control group(±s，n=8)

表1 兩組小鼠肺功能結果比較(±s，n=8)Tab.1 Comparison of pulmonary function between CS－exposed group and control group(±s，n=8)

注:*與正常對照組比較，P＜0.05Note:*P＜0.05 vs.control group

分組Group氣道阻力Airway resistance，kPa/(L·S)動態(tài)肺順應性Dynamic lung compliance (L/kPa)呼氣峰流速Peak expiratory flow rate，(mL/S)正常對照組(Control group)0.0365±0.020 0.3100±0.1367 8.38±1.08煙霧暴露組(CS－exposed group) 0.3179±0.097*0.1019±0.0004*7.20±0.97

2.3 BALF細胞計數(shù)及分類

應用改進方法BALA回收率高達90%以上，正常對照組及煙霧暴露組BALF回收率分別為(91.3 ±1.0)%、(90.5±1.3)%，兩組BALF回收量及回收率無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。煙霧暴露組小鼠BALF細胞總數(shù)高于對照組，巨噬細胞數(shù)(AM)、中性粒細胞數(shù)(N)、中性粒細胞所占比例(N%)也高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)。見表2。

表2 小鼠BALF中細胞計數(shù)及分類結果比較(±s，n=8)Tab.2 Comparison of cell counts and classification in BALF between CS－exposed group and control group(±s，n=8)

表2 小鼠BALF中細胞計數(shù)及分類結果比較(±s，n=8)Tab.2 Comparison of cell counts and classification in BALF between CS－exposed group and control group(±s，n=8)

注:*與正常對照組比較，P＜0.05Note:*P＜0.05 vs.control group

組別Group細胞總數(shù)Total cells(×108/L)巨噬細胞Macrophages (×108/L)巨噬細胞百分比Macrophage(%)中性粒細胞neutrophils (×107/L)中性粒細胞百分比neutrophil(%)正常對照組(Control group)1.47±0.24 1.34±0.14 87±9 0.77±0.09 8.7±1.0煙霧暴露組(CS－exposed group)5.85±0.67*4.45±0.63*76±8 7.76±0.92*13.7±2.4*

2.4 小鼠肺組織病理學改變及形態(tài)定量分析

正常對照組在各時間點肺組織病理無明顯變化。與正常對照組小鼠比較(圖2－A)，煙霧暴露30 d時小鼠肺組織可見炎癥細胞浸潤、部分肺泡腔輕度擴大(圖2－B);至第90天時出現(xiàn)明顯肺泡腔擴大、肺泡壁變薄、肺泡間隔破裂及肺泡腔融合，肺氣腫形成(圖2－C);停止煙霧暴露30 d，亦可見明顯肺泡腔擴大及融合(圖2－D)。停止煙霧暴露30 d，比較正常對照組及煙霧暴露組平均內襯間隔(MLI)及肺泡破壞指數(shù)(DI)，可見煙霧暴露組小鼠肺組織MLI及DI均較正常對照組高，差異有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)。見表3。圖2見彩插2。

表3 小鼠肺組織MLI、DI結果(±s，n=8)Tab.3 The results of MLI and DI in mice(±s，n=8)

表3 小鼠肺組織MLI、DI結果(±s，n=8)Tab.3 The results of MLI and DI in mice(±s，n=8)

注:*與正常對照組比較，P＜0.05;MLI為平均內襯間隔;DI為肺泡破壞指數(shù)Note:*P＜0.05 vs.control group.

組別Group MLI Mean linear intercept(μm) DI Destructive index(%)正常對照組(Control group)33±3 13±3煙霧暴露組(CS－exposed group)52±7*39±4*

觀察兩組小氣道病理表現(xiàn)，可見正常對照組小鼠氣道壁結構清楚，氣道上皮排列整齊，未見明顯上皮脫落(圖3－A)。而煙霧暴露組小鼠氣道上皮排列紊亂、部分脫落、局部氣道上皮增生(箭頭E所示)、管壁增厚、管腔變小;氣道周圍大量炎癥細胞浸潤(箭頭I所示)、部分氣道周圍肺泡等支撐結構缺失(箭頭S所示)并伴有局部平滑肌增生(箭頭SM所示)(圖3－B，圖3－C)。圖3見彩插2。

3 討論

COPD是一種嚴重危害人類健康的疾病，其發(fā)病率及病死率呈逐年上升的趨勢。COPD發(fā)病機制不明，缺乏有效治療方法，許多學者紛紛通過COPD動物模型的構建和研究，以進一步闡明COPD發(fā)病機制，尋找有效的治療途徑。對于肺氣腫模型的建立成功與否，國內學者鄭鴻翱［5］提出一個符合臨床實際的理想COPD動物模型應滿足以下條件:(1)致傷因素與臨床COPD常見誘因基本一致;(2)必須有氣流阻塞存在，小氣道阻力增高，Cdyn下降; (3)氣道重塑/建;(4)可伴有氣道高反應性。該標準結合肺組織病理改變可以比較客觀評價COPD動物模型。

長期吸煙是導致人類小葉中央型肺氣腫的主要誘發(fā)因素，且煙霧暴露法較急性傷害性模型能模擬人長期吸煙引起的慢性發(fā)病過程，因此煙霧暴露誘發(fā)的動物模型的研究已成為肺氣腫研究領域中的熱點。我們既往研究［6，7］采用煙霧暴露成功建立COPD大鼠模型，并證實吸煙可致SD大鼠肺內出現(xiàn)炎癥反應、氧化應激及蛋白酶/抗蛋白酶失調，但個體間存在一定的差異，造模過程中有4只大鼠死亡。

目前國內關于煙霧暴露所致肺氣腫小鼠模型研究十分少見。國內煙霧暴露所致肺氣腫模型大多采用SD及W istar大鼠，均屬封閉群，個體間遺傳性差異較大，實驗可重復性差，且SD大鼠對煙霧刺激及呼吸系統(tǒng)疾病有較強的抵抗;但采用近交系大鼠則實驗成本較高。而小鼠作為一種常用的實驗動物，具有價格便宜、繁殖和發(fā)育速度快、生理上個體差異較少等優(yōu)點。此外，小鼠生物進化上與人類非常接近，其組織器官結構和細胞功能與人相似，人類99%的基因存在于小鼠，93%的小鼠區(qū)域基因排列順序與人類相同，小鼠的許多疾病模型與人類同種疾病有著較高的可比性。且本研究采用的C57BL/ 6J小鼠為標準的近交系小鼠，個體差異很小，模型可重復性好，在國外廣泛應用于肺部及其他疾病動物模型的研究中。

March等［8］研究發(fā)現(xiàn)就吸煙誘導的肺氣腫而言，B6C3F1小鼠較F344大鼠更敏感。Nikula等［9］研究表明吸煙所致小鼠模型是一種可靠的肺氣腫動物模型。Yao等［10］通過煙霧刺激C57BL/6J、A/J、AKR/J、CD－1及129SvJ五種不同品系小鼠，發(fā)現(xiàn)C57BL/6J小鼠對煙霧刺激高度敏感。Valenca等［11］將C57BL/6小鼠暴露于香煙煙霧中，3支香煙/次，3次/日，60 d后觀察肺病理可見肺氣腫樣改變，伴肺泡巨噬細胞增多、細胞外基質改變及MMP－12表達增加。Van der Strate等［12］研究采用C57BL/ 6J小鼠，對鼻噴煙，2次/日，2支/次，10噴/支，每周5 d，發(fā)現(xiàn)小鼠煙熏至4個月后發(fā)生氣腔擴大，并隨熏煙時間增加而增加;同時煙熏小鼠肺組織有與人類肺氣腫相似的隨肺氣腫進行性增加的B淋巴細胞濾泡。由此可見，煙霧暴露所致肺氣腫C57BL/6J小鼠肺內存在與人類相似的病理生理改變，但上述研究均未對煙霧暴露停止后肺病理變化進行觀察，且較少應用肺功能對模型可靠性進行評價。

本研究采用自制煙霧暴露箱對C57BL/6J小鼠進行全身香煙煙霧暴露，6支/次，4次/日，連續(xù)90 d，建立肺氣腫小鼠模型，造模時間與國外研究［11，12］不一致，考慮與香煙種類、煙霧暴露方式、煙霧濃度、暴露時間及暴露頻度有關。在造模過程無小鼠死亡，說明該方法安全性好。

肺功能是評價肺氣腫模型建立的重要評價標準之一，本研究采用國際公認的BUXCO小動物肺功能檢測系統(tǒng)，該設備技術先進、檢測精確、數(shù)據(jù)可靠，國內僅有為數(shù)不多的幾家大型科研單位擁有該設備。同時在檢測過程中嚴格控制操作統(tǒng)一性，保證肺功能的結果可靠性。肺功能檢查顯示煙霧暴露組小鼠流量－時間曲線的呼氣部分曲線上升支陡直，提示肺組織彈性較差;而后下降緩慢并伴有頓挫，呼氣相延長提示小氣道存在阻塞，呼出氣流不暢。進一步肺功能數(shù)據(jù)分析顯示:煙霧暴露組小鼠Raw明顯增高，Cdyn明顯下降，提示氣道阻塞、肺動態(tài)順應性下降，與COPD病理生理變化特點相符合。

BALF中炎癥細胞計數(shù)及分類是反映氣道炎癥的一個重要指標，本研究中行單側BAL結果示煙霧暴露組小鼠BALF中性粒細胞及巨噬細胞均增加，且以中性粒細胞增加為主，提示煙霧暴露可致肺局部炎癥細胞的聚集，繼而活化釋放一系列炎癥因子、趨化因子、氧自由基與蛋白酶等，導致炎癥反應及蛋白酶/抗蛋白酶失衡等一系列病理生理過程，參與肺氣腫形成。

本研究亦初步觀察了兩組不同時間點肺組織病理改變，發(fā)現(xiàn)正常對照組小鼠各時間點肺部病理表現(xiàn)未見明顯差異，無自發(fā)性肺氣腫形成，與進一步論證該小鼠用于建立實驗性肺氣腫模型的可行性。而煙霧暴露組煙霧暴露第30天時小鼠肺組織即有局部炎癥細胞浸潤及部分肺泡腔擴大;繼續(xù)暴露至第90天時可見典型的肺氣腫病理改變。停止煙霧暴露并觀察30 d，發(fā)現(xiàn)小鼠肺組織肺氣腫程度未見減輕，似乎有進展趨勢，提示所建肺氣腫模型穩(wěn)定性好且與人類COPD戒煙后肺損害持續(xù)進展的病程規(guī)律相符。而對于肺氣腫動物模型小氣道的觀察，國內研究報道少，我們的研究發(fā)現(xiàn)煙霧暴露組氣道上皮排列紊亂、局部上皮增生、氣道周圍炎癥浸潤、支撐結構缺失及平滑肌增生，提示煙霧暴露組存在氣道重塑，與人類COPD表現(xiàn)一致。

上述肺功能、氣道炎癥及病理學評價指標證實該C57BL/6J小鼠肺氣腫模型建立成功，符合人類COPD改變，且穩(wěn)定性較好。

小鼠體積小，氣管及支氣管亦較細小且柔軟，使用注射器法行BAL時極易損傷而致漏液及灌洗失敗，影響進一步的研究。本研究組采用普通靜脈留置針行灌洗術，成功率高。具體做法是:輕柔暴露氣管后，絲線置于氣管下備用，持靜脈留置針自氣管上段穿刺成功后退金屬內芯并將塑料套管緩慢送入氣管約0.4～0.8 cm，結扎氣管，拔出金屬內芯，留置針尾接1.0 m L注射器針筒行BAL，行BAL時回抽負壓應盡量小，以有液體緩緩流出為宜，同時可適當改變動物體位以利于回收液體。而行單側BAL時，可采用先從胸側壁打開一側胸腔沿肺葉向上尋找該側主支氣管并予結扎，自氣管處置靜脈留置針行對側BAL，操作簡單，無需完整分離雙肺及主支氣管。該方法損傷小，操作簡單，灌洗成功率100%，回收率高達90%～92%;但該方法使用的直型靜脈留置針成本較普通注射器高，不可高壓消毒以重復利用，如實驗不要求無菌則可清洗干凈后重復使用。

本研究結果顯示，煙霧暴露90 d可致C57BL/6J小鼠肺泡壁變薄、肺泡間隔破裂、肺泡腔擴大及融合、肺氣腫形成，停止煙霧暴露后肺部病理改變不會減輕，且肺功能及氣道炎癥指標均證實模型的建立成功。本研究建立的煙霧暴露所致C57BL/6J小鼠肺氣腫模型能較好地模擬人類COPD病理生理改變、慢性發(fā)病及進展的病程規(guī)律。該建模方法安全、經(jīng)濟、可靠且穩(wěn)定性好，為進一步研究研究COPD的發(fā)病機制及尋找有效治療方法提供了一個非常好途徑。

(本文圖2，3見彩插2。)

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Establishm ent and Assessm ent of a M ouse M odel of Cigarette Sm oke-Induced Em physem a

CAO Jun，CHEN Ping，YANG Yue，OUYANG Ruo－yun，PENG Hong
(Department of Respiratory Medicine，the Second XiangYa Hospital of Central South University，Changsha 410011，China)

Objective To set and evaluate a mouse model of cigarette smoke(CS)－induced emphysema and improve the method of bronchoalveolar lavage(BAL).M ethods Adult(n=10，18～20 g body wt)male C57BL/6J mice(CS－exposed group)were exposed 4 times per day，whole body，to CS from six cigarettes for consecutive 90 days and then to observe for another 30 days.The control group(n=10)was sham－smoked.An improved method of bronchoalveolar lavage was used and the data of pulmonary function，bronchoalveolar lavage fluid(BALF)and morphological manifestations were collected.Results Compared with the control group，the CS－exposed group owned higher airway resistance(Raw)，lower dynamic lung compliance(Cdyn)，more macrophages and neutrophils in BALF(all P＜0.05).Morphological detection showed significant enlarged airspace，disruption of alveolar septa and formation of emphysema.After using the improved method，success rate of BAL reached to 100%，and recovery rate was up to 90%.ConlusionCigarette smoke can induce emphysema stably in mice and this mouse model shows high similarity to human chronic obstructive pulmonary disease and is easy to manipulate after methodologic improvement.

Chronic obstructive pulmonary disease;Emphysema;Cigarette smoke;Animal model; Bronchoalveolar lavage

R－563.3，R－332

A

1005－4847(2010)04－0278－05

2009－12－18

國家科學自然基金資助項目(編號:30770931，30800503);湖南省自然科學基金資助項目(編號:09JJ3036，07JJ3037)。

曹君(1983－)，女，中南大學湘雅二醫(yī)院呼吸內科在讀博士生，主要研究方向:慢性阻塞性肺疾病發(fā)病機制，Email:path_cj71@ yahoo.com.cn

陳平，E－mail:chenping101@hotmail.com，Tel:13873115563