舒必利與垂體移植誘發(fā)小鼠子宮腺肌病的比較

饒妍妍，項(xiàng)雙衛(wèi)

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院，福州 350001)

研究報(bào)告

舒必利與垂體移植誘發(fā)小鼠子宮腺肌病的比較

饒妍妍，項(xiàng)雙衛(wèi)

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院，福州 350001)

目的比較舒必利誘導(dǎo)和垂體移植誘導(dǎo)兩種造模方法的效果，評(píng)價(jià)適用于子宮腺肌病研究的小鼠模型。方法45只7周齡未曾受孕的雌性BALB/c小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、舒必利組和垂體移植組，每組15只。舒必利組每日皮下注射舒必利，每20 g體重注射800 μg，垂體移植組則將同種同齡雄鼠的垂體放入雌鼠右側(cè)子宮內(nèi)，對(duì)照組不予任何處理。5個(gè)月后以子宮濕重、終末體重、子宮濕重/終末體重的比值、卵巢濕重、子宮HE染色評(píng)分及模型成功率等指標(biāo)評(píng)價(jià)造模效果。結(jié)果5個(gè)月后舒必利組和垂體移植組小鼠的子宮濕重、子宮濕重/終末體重的比值、子宮HE染色評(píng)分及成功率均顯著高于對(duì)照組，但兩模型組各項(xiàng)指標(biāo)比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，三組小鼠終末體重和卵巢濕重比較差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論對(duì)照組無(wú)一例形成子宮腺肌病，舒必利誘導(dǎo)和垂體移植誘導(dǎo)兩種造模方法均可引起小鼠子宮腺肌病，造模的各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)均無(wú)顯著差異，都可用于子宮腺肌病的研究。

子宮腺肌病;小鼠;模型，動(dòng)物;垂體移植

在子宮腺肌病的基礎(chǔ)研究中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)占有重要地位，建立穩(wěn)定可行的動(dòng)物模型是科學(xué)研究的基礎(chǔ)，建立子宮腺肌病動(dòng)物模型的方法主要有“藥物誘導(dǎo)法”和“手術(shù)誘導(dǎo)法”。國(guó)外常把SHN小鼠作為研究子宮腺肌病的動(dòng)物模型，但是該品種尚未引進(jìn)國(guó)內(nèi)，這是國(guó)內(nèi)關(guān)于子宮腺肌病動(dòng)物研究相對(duì)滯后的原因之一。BALB/c小鼠是目前國(guó)內(nèi)外有報(bào)道用于研究子宮腺肌病的模型動(dòng)物［1，2］，本研究采用BALB/c小鼠對(duì)舒必利誘導(dǎo)與垂體移植誘導(dǎo)兩種造模方法的效果進(jìn)行比較分析。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物及分組:清潔級(jí)未曾受孕的7周齡雌性BALB/c小鼠45只，體質(zhì)量(19.45±0.66)g，來(lái)源于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司［SCXK (滬)2007－2005］，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。隨機(jī)分為舒必利組、垂體移植組和對(duì)照組，每組15只。7周齡雄性BALB/c小鼠15只，體質(zhì)量(18.65±0.41)g(來(lái)源同雌性BALB/c小鼠)。恒溫清潔環(huán)境飼養(yǎng)，小鼠自由攝食和飲水，光照為明/暗每12 h交替。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)所需藥品和手術(shù)器械:生理鹽水、舒必利注射液(福建省精神衛(wèi)生中心，批號(hào)H43020575)、10%水合氯醛、4%多聚甲醛、碘伏、無(wú)菌小手術(shù)器械一套、注射器、小鼠固定板、眼科縫合針線。

1.2 方法

1.2.1 模型建立:①舒必利組:雌性BALB/c小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，每日皮下注射舒必利，每20 g體重注射800 μg，1日的量分2次于9 AM和3 PM溶解于0.1m L生理鹽水中注射，共5個(gè)月后處死。②垂體移植組:雌性BALB/c小鼠7周齡時(shí)子宮發(fā)育明顯粗大，有利于進(jìn)行垂體移植手術(shù)。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，無(wú)菌條件下，用10%水合氯醛(0.3 m L/100 g)腹腔注射麻醉，固定小鼠四肢及頭部于鼠板上;腹部脫毛，常規(guī)消毒皮膚，于下腹正中尿道上約0.5～1cm處縱向切開(kāi)，分離右側(cè)子宮，在距離兩子宮連接部0.5 cm處剪一小口。同時(shí)脫頸處死一只同種同齡雄鼠，開(kāi)顱取出腦垂體，將垂體從小切口處放入右側(cè)子宮腔，用眼科鑷將垂體輕輕推至子宮末端(近卵巢處)，小切口無(wú)需縫合，將子宮放回腹腔內(nèi)，常規(guī)間斷縫合關(guān)腹。垂體移植術(shù)后5個(gè)月處死。③對(duì)照組:不予任何處理，在相同環(huán)境中正常飼養(yǎng)，5個(gè)月后處死。

1.2.2 觀察指標(biāo)

(1)一般觀察:實(shí)驗(yàn)期間觀察每組小鼠的飼料攝入量和體重增加情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每組小鼠稱(chēng)重后引頸處死，取出子宮和卵巢，去凈周?chē)窘M織，分別稱(chēng)重，計(jì)算子宮濕重/終末體重的比值，并加以比較，將子宮置于20倍放大鏡下仔細(xì)觀察其外觀變化。

(2)病理組織形態(tài)學(xué)觀察:據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道垂體移植側(cè)(右側(cè)子宮)子宮腺肌病的發(fā)病速度更快且病變程度嚴(yán)重，因此本文統(tǒng)一取右側(cè)子宮作為研究對(duì)象。將右側(cè)子宮和卵巢放入4%多聚甲醛中固定，脫水，透明、浸蠟、包埋，制成蠟塊。在切片機(jī)上切成7 μm的薄片，HE染色檢查，觀察子宮內(nèi)膜組織侵入肌層的程度，按照Mori和Nagasawa［3］的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為0級(jí):正常子宮;1級(jí):子宮內(nèi)膜間質(zhì)侵入肌肉內(nèi)層;2級(jí):子宮內(nèi)膜間質(zhì)和腺體侵入肌肉內(nèi)層;3級(jí):子宮內(nèi)膜組織侵入內(nèi)外肌層交界處;4級(jí):子宮內(nèi)膜腺體囊性增生并出現(xiàn)漿膜下結(jié)節(jié)。每只小鼠子宮取4個(gè)以上橫斷面，按照侵入程度分級(jí)取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般觀察

垂體移植組小鼠術(shù)中因麻醉意外死亡1只，其余活動(dòng)正常。舒必利組小鼠健康無(wú)死亡，每日皮下注射后活動(dòng)減少，半小時(shí)后進(jìn)入睡眠狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠飼料攝入量和體重增加情況無(wú)明顯差別。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，舒必利組與垂體移植組小鼠肉眼觀子宮呈暗紅色，明顯充血，增粗，局部膨大，但均未見(jiàn)子宮表面腺肌病結(jié)節(jié)。對(duì)照組小鼠子宮呈淡紅色，表面光滑，較細(xì)，粗細(xì)均勻，未見(jiàn)子宮腺肌病結(jié)節(jié)。經(jīng)單因素方差分析檢驗(yàn)，各組小鼠子宮濕重與子宮濕重/終末體重之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(子宮濕重F=22.92，P＜0.05;子宮濕重/終末體重F= 176.32，P＜0.05)，舒必利組與垂體移植組均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，但前兩者之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，各組小鼠終末體重和卵巢濕重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(終末體重F=2.921，P= 0.065;卵巢濕重F=3.635，P=0.035)(詳見(jiàn)表1)。

2.2 病理組織學(xué)檢查

經(jīng)顯微組織切片HE染色證實(shí)(見(jiàn)圖1，彩插8)，舒必利組12只(80.0%)小鼠成功誘發(fā)子宮腺肌病形成，垂體移植組13只(86.67%)小鼠成功誘發(fā)子宮腺肌病形成。對(duì)照組15只均未發(fā)現(xiàn)子宮腺肌病形成。子宮腺肌病發(fā)病率和HE染色評(píng)分各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(發(fā)病率χ2=28.260，P＜0.05;HE染色評(píng)分F=210.135，P＜0.05)。發(fā)病率用χ2分割法進(jìn)行兩兩比較，舒必利組與垂體移植組差異無(wú)顯著性(P=1.00)，舒必利組與垂體移植組均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。HE染色評(píng)分采用S－N－K法進(jìn)行兩兩比較，舒必利組與垂體移植組差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，舒必利組與垂體移植組顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，詳見(jiàn)表1。

表1 各組對(duì)子宮腺肌病的影響(±s，n=15)Tab.1 The impact of modeling methods on adenomyosis in each group(±s，n=15)

表1 各組對(duì)子宮腺肌病的影響(±s，n=15)Tab.1 The impact of modeling methods on adenomyosis in each group(±s，n=15)

注:與對(duì)照組比較:★P＜0.05;與舒必利組比較:▲P＞0.05Note:n=15.Compared with the control group:★P＜0.05;Compared with the sulpiride group:▲P＞0.05

分組Group子宮濕重(mg) Uterine wet weight終末體重(g) Body weight子宮濕重/終末體重Ratio of uterine wet weight/body weight卵巢濕重(mg) Ovarian wet weight HE染色評(píng)分Scores of HE stained uterine發(fā)病率(%) Disease incidence對(duì)照組Control 56.27±9.91 26.88±1.20 2.09±0.36 12.64±0.86 0.00±0.00 0.00舒必利組Sulpiride 91.68±1.60★26.14±1.21 3.51±0.16★13.57±2.79 2.60±0.51★80.00★垂體移植組Pituitary transplantation 92.39±1.39★▲25.98±0.80 3.56±0.36★▲11.86±0.74 2.67±0.49★▲86.67★▲

3 討論

子宮腺肌病是指子宮內(nèi)膜侵入子宮肌層的一種良性病變，病變未超出子宮體范圍，是一種婦科常見(jiàn)病，其發(fā)病率近年來(lái)呈上升趨勢(shì)，且有年輕化傾向。是引起痛經(jīng)和月經(jīng)過(guò)多的主要原因之一，但病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚。在人體中很難進(jìn)行對(duì)照研究，因此限制了子宮腺肌病的研究進(jìn)展。建立合適的動(dòng)物模型對(duì)該病的發(fā)生、發(fā)展、治療及預(yù)防等研究起重要作用。

目前小鼠是子宮腺肌病研究中使用最多的模型動(dòng)物。小鼠性成熟早(6～7周齡)，性周期短(4～5 d)，生長(zhǎng)繁殖快，易于控制。有關(guān)子宮腺肌病動(dòng)物模型的造模方法，大致分為藥物誘導(dǎo)法和手術(shù)誘導(dǎo)法。通過(guò)干預(yù)可明顯縮短小鼠子宮腺肌病的發(fā)病時(shí)間，加重發(fā)病程度。藥物誘導(dǎo)常用多巴胺－2受體抑制劑(舒必利、奮乃靜與滅吐靈)、雌激素、孕激素、雌激素聯(lián)合孕激素和催乳素等，據(jù)報(bào)道雌激素誘導(dǎo)子宮腺肌病動(dòng)物模型常常并發(fā)子宮內(nèi)膜異常增生和子宮內(nèi)膜癌，不做為研究腺肌病的理想模型，因此本實(shí)驗(yàn)采用舒必利(多巴胺－2受體抑制劑)誘導(dǎo)法。手術(shù)誘導(dǎo)法包括將異體垂體移植至子宮腔誘發(fā)子宮腺肌病和將異體垂體移植至腎包膜下誘發(fā)子宮腺肌病。本實(shí)驗(yàn)采用應(yīng)用較廣泛的將異體垂體移植到子宮腔誘發(fā)法。其模型的發(fā)生率、程度和所需時(shí)間受小鼠品系影響［4］。國(guó)外研究表明，在SHN、C3、SLN、BALB/c、C57BLC3H×BALBPc之F1代小鼠和W istar大鼠中，SHN小鼠發(fā)病率最高，所需時(shí)間最短。Nagasawa等最早報(bào)道的子宮腺肌病模型，應(yīng)用的是SHN小鼠，通過(guò)異體垂體移植手術(shù)三個(gè)月后發(fā)病率達(dá)100%，96%小鼠的腺肌病病灶突出子宮漿膜層，形成漿膜下腺肌病結(jié)節(jié)［5］。SHN系小鼠來(lái)源于瑞士白化病小鼠，在自發(fā)乳房腫瘤的同時(shí)發(fā)生腺肌病，其子宮腺肌病發(fā)生率最高［6～8］，由于目前我國(guó)仍未引進(jìn)該品系，價(jià)格昂貴，購(gòu)買(mǎi)困難，因此是國(guó)內(nèi)子宮腺肌病動(dòng)物研究相對(duì)滯后的原因之一［9］。BALB/c小鼠國(guó)內(nèi)容易獲取，價(jià)格不貴，屬近交系，可避免移植排斥反應(yīng)，國(guó)內(nèi)外有使用BALB/c小鼠造模成功的報(bào)道，國(guó)內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)BALB/c小鼠經(jīng)異體垂體移植后6個(gè)月，子宮腺肌病發(fā)病率高達(dá)90%，因此本實(shí)驗(yàn)選用BALB/c小鼠進(jìn)行研究［1］。

舒必利為多巴胺－2受體抑制劑(多巴胺通過(guò)下丘腦或直接對(duì)腺垂體催乳素分泌有抑制作用)，促進(jìn)腺垂體釋放催乳素，引起高催乳素血癥，從而抑制雌激素和黃體生成素的分泌，抑制排卵，延長(zhǎng)動(dòng)情周期(延長(zhǎng)動(dòng)情間期和動(dòng)情后期);子宮肌層長(zhǎng)時(shí)間暴露PRL可導(dǎo)致肌層變性，利于子宮內(nèi)膜的侵入;同時(shí)催乳素可促進(jìn)雌激素與其受體結(jié)合，削弱子宮肌層的防御功能從而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜向肌層生長(zhǎng);催乳素亦通過(guò)刺激卵巢黃體，促進(jìn)孕激素分泌，孕激素又可促進(jìn)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘發(fā)子宮腺肌病高發(fā)病率［10］。垂體移植誘發(fā)子宮腺肌病的發(fā)病機(jī)制與前者相似，由于小鼠子宮分泌的宮腔液含有豐富營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而使得垂體移植術(shù)后垂體能夠繼續(xù)存活，并引起高催乳素血癥，據(jù)Mori報(bào)道垂體移植術(shù)后20 d，血PRL是對(duì)照組的10倍;移植后4～6個(gè)月，小鼠子宮PRL受體的mRNA總量是正常的2～10倍［11］。目前認(rèn)為催乳素在子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展中起觸發(fā)作用，雌激素和孕激素起進(jìn)一步損傷作用［2］，這種激素失衡導(dǎo)致了病變的發(fā)生發(fā)展。

通過(guò)對(duì)子宮濕重、子宮濕重/終末體重、HE染色評(píng)分及發(fā)病率等方面的比較，舒必利組和垂體移植組的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，雖然子宮表面未出現(xiàn)子宮腺肌病結(jié)節(jié)，但其顏色較對(duì)照組深，充血，局部出現(xiàn)膨大，HE染色證實(shí)該兩種方法誘導(dǎo)子宮腺肌病發(fā)病率高，由此可見(jiàn)BALB/c小鼠可作為較理想的模型動(dòng)物。在操作可控性方面，舒必利誘導(dǎo)法簡(jiǎn)單易行，死亡率低，成本低，即使是初學(xué)者造模也容易成功，但其操作過(guò)于繁瑣;垂體移植誘導(dǎo)法對(duì)操作者的熟練程度有一定的要求，初學(xué)者可能因操作不慎在造模過(guò)程中破壞垂體的完整性，大面積損傷子宮，術(shù)后感染，而影響模型成功率，甚至引起小鼠死亡。

本研究?jī)煞N造模方法最終都成功地誘發(fā)了小鼠子宮腺肌病，其病理組織學(xué)檢查均與人類(lèi)的病理學(xué)改變相近似，因此可作為子宮腺肌病研究的模型，實(shí)驗(yàn)者可根據(jù)自身?xiàng)l件選擇合適的模型。

(本文圖1見(jiàn)彩插8。)

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Com parison of Two M ouse M odels of Adenom yosis Estab lished by Sulpiride-Induction and Pituitary Transp lantation

RAO Yan－yan，XIANG Shuang－wei
(A ffiliated Union Hospital of Fujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350001，China)

ObjectiveThe purpose of this study was to compare the adenomyosis models in m ice generated by two different methods.M ethods Intact 7－week old，never－pregnant female BALB/c mice were random ly divided into 3 groups:control group，sulpiride group and pituitary transplantation group，15 mice in each group.M ice of the sulpiride group were given subcutaneous injections of 800 μg sulpiride per 20 g body weight daily for 5 months.A single pituitary from male mouse was transplanted into the lumen of the right uterus of mice in the pituitary transplantation group.The control group received no treatment.A ll m ice were killed after 5 months and the uteri and ovaries were weighed.The right uterus was examined under a 20－fold microscope.Results 5 months later，compared with the control group，the uterine wet weight，the ratio of wet uterus weight/body weight，morphology of HE stained uterine tissue and disease incidence were significantly increased(P＜0.05)in both two model groups.There was no statistical difference in the body weight and the ovarian wet weight(P＞0.05).ConlusionThere are no significant differences in the evaluation indexes between the sulpiride treatment and pituitary transplantation groups.Both the two methods can be used to successfully establish mouse models of adenomyosis for research of this disease.

Adenomyosis;M ice;Disease models，animal;pituitary transplantation;Sulpiride

R711.51

A

1005－4847(2010)03－0258－04

2009－10－18

饒妍妍(1982－)，女，研究方向:子宮腺肌病。E－mail:raoyanyan1998@yahoo.com.cn

項(xiàng)雙衛(wèi)。E－mail:weijianxianggood@yahoo.com.cn