羊骨酶解發酵液鈣鰲合物對骨質疏松大鼠骨密度和骨代謝生化指標的影響

霍乃蕊，馬儷珍，忻欣，孔保華，陳紅芳，盧軍

(1.山西農業大學食品科學與工程學院，太谷 030801;2.天津農學院食品科學系，天津 300384; 3.東北農業大學食品學院，哈爾濱 1500302)

研究報告

羊骨酶解發酵液鈣鰲合物對骨質疏松大鼠骨密度和骨代謝生化指標的影響

霍乃蕊1，馬儷珍2，忻欣3，孔保華3，陳紅芳2，盧軍3

(1.山西農業大學食品科學與工程學院，太谷 030801;2.天津農學院食品科學系，天津 300384; 3.東北農業大學食品學院，哈爾濱 1500302)

目的探討羊骨酶解發酵液鈣螯合物(SBEF－Ca)對雌激素缺乏造成的骨質疏松的防治作用。方法

40只3.5 月齡的Sprague－Daw ley大鼠，按體重隨機分為正常組(假手術+蒸餾水)、模型對照組(去卵巢+蒸餾水)和高、中、低3個劑量組(去卵巢+SBEF－Ca)。術后12 d，持續灌胃11周后，測定股骨密度、長度以及血清中反映骨代謝的主要生化指標。結果模型對照組大鼠股骨密度和長度顯著減小，各劑量組均可扭轉這種減小趨勢并使股骨密度和長度維持在正常組水平，其中高劑量組的股骨密度顯著大于中、低劑量組;各劑量組的股骨長度差異不顯著;所有大鼠的血Ca、血P水平差異無顯著性;模型對照組的血清堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(BGP)水平明顯升高，而各劑量組的ALP、BGP水平與正常組差異不顯著，且高劑量組ALP水平顯著低于中、低劑量組，中、高劑量組的BGP水平(P＞0.05)顯著低于低劑量組。結論低、中、高劑量的SBEF－Ca對絕經后骨質疏松癥有預防作用。

羊骨酶解發酵液;去卵巢大鼠;骨密度;生化指標

注: A為正常子宮(左)和去卵巢大鼠子宮(右);B依次為低、中、高劑量組大鼠子宮圖1 各組大鼠的子宮形態Note: Picture A shows the uteri of a normal grouP rat (left) and model grouP rat (right); Picture B shows the uteri from rats of low-dose, medium-dose and high-dose grouPs in sequence.Fig.1The gross aPPearance of the uteri in the rats of different grouPs

近20年來的研究證實了Ca在許多疾病防治中潛在作用，這些疾病包括骨質疏松、高血壓、結腸癌、乳腺癌、腎結石、卵巢癌、經前綜合征、多囊性卵巢綜合征，胰島素抵抗綜合征、肥胖癥以及鉛中毒等［1］。鈣質缺乏是全球性問題，我國尤為嚴重［2］。

骨質疏松癥是一種復雜的，由多種因素引起的以骨量減少，骨微觀結構退化，脆性增加以及易于發生骨折為特征的一種非特異性骨代謝障礙疾病［3］。骨質疏松的發生與低鈣攝入有關［1］。骨質疏松對發病率和死亡率的影響巨大［4］。中年期，骨吸收大于骨形成，骨量持續丟失，婦女在絕經后的5～15年由于雌激素分泌減少，骨量減少尤為突出［3］。在美國，骨質疏松已達到了流行的比例［5］。

我國是世界畜產大國，畜骨資源豐富，但缺乏深度開發利用。骨的營養價值很高，骨骼中80%～90%的礦物質為Ca和P［5］。占骨骼總蛋白90%的膠原蛋白呈三螺旋結構，生物利用度很低，酶解可將其水解為極易被機體吸收的小分子多肽，而使其生物利用度大幅提高。蛋白肽的制備方法有生物提取、酸堿水解、化學合成、酶法生產和發酵提取法。酶解法是目前生產活性肽的最主要的方法，發酵提取法兼有酸解、酶解和生物轉化的共同作用，可以有效增加蛋白質水解率和骨鈣的轉化率，目前較多用于補鈣劑的開發［6］。

去卵巢大鼠模型一直用于絕經后骨質疏松癥的研究，利用老齡大鼠和成年大鼠均可建立骨質疏松模型。利用這個模型，篩選出了許多治療骨質疏松的有效藥物或療法，包括雌激素、雌激素受體調節劑、雙磷酸鹽、降鈣素、合成類固醇［7］等。上述各種藥物雖可有效預防和治療絕經后骨質疏松和降低骨折的危險性，但具有一些不可避免的不良反應［8］。因此安全的、無毒副作用的，可以長期使用的骨質疏松防治藥物或鈣制劑的開發具有現實意義。

本研究聯用酶解和發酵方法，制備羊骨酶解發酵液鈣螯合物(sheep bone enzymatic fermentationcalcium chelate，SBEF－Ca)，以卵巢摘除大鼠為骨質疏松模型，研究SBEF－Ca對骨代謝、骨密度等的影響，探討SBEF－Ca對雌激素缺乏引起的骨質疏松癥的防治作用，為畜骨的深度開發利用、安全的補鈣保健產品或食品添加劑的開發和商品化生產提供可靠的依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

40只未交配過的健康雌性SD大鼠，3.5月齡，體質量250～280 g，遺傳背景明確，來源于中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物中心【SCXK(京) 2005－0001】，使用時遵循減少、替代和優化的3R原則。每飼養箱5只，環境溫度(24±2)℃，相對濕度40%～60%，光照為12 h光/12 h暗，自由采食和飲水。飼料為天津市華榮實驗動物科技有限公司提供的基礎飼料。按體重隨機分為5組(每組8只):正常組(假手術);模型對照組(去卵巢)和高、中、低劑量組(去卵巢并灌喂SBEF－Ca)。麻醉后由腰椎旁兩側切口入腹腔，用鑷子將卵巢牽拉至腹腔外，正常組將卵巢牽拉后再送回，其余大鼠均結扎去除雙側卵巢，切口局部涂碘伏后止血縫合。術后康復12 d，給予各組大鼠不同的處理，連續11周。正常組和模型對照組灌胃給予蒸餾水［10 m L/(kg·d)，ig］;各劑量組以同樣方式給予SBEF－Ca:高劑量組［5000 mg/(kg·d)，ig］;中劑量組［3000 mg/(kg·d)，ig］;低劑量組［1000 mg/(kg·d)，ig］。

1.2 SBEF-Ca制備

新鮮羊骨洗凈、高壓、去油、烘干、粉碎，用胃蛋白酶酶解:酶添加量為1900 U/g，骨粉底物濃度0.2 kg/L，pH 3.0，37℃酶解6 h后，90℃滅酶10 m in。冷卻至室溫，添加葡萄糖(3.93%)，植物乳桿菌和戊糖片球菌(1∶1)的接種比例為8.7%，發酵18.9 h。發酵后離心，噴霧干燥，制得SBEF－Ca。經測定其中的粗蛋白含量為42.4%，鈣含量為21.1%，總糖含量為8.06%，灰分(不包括Ca)為10.9%。使用時以蒸餾水將樣品分別配成500、300、100 mg/m L的溶液，然后按照10 m L/(kg·d)分別給予高、中、低三組實驗動物。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 一般指標:實驗開始后每日觀察動物的一般情況，如食欲、精神狀態、死亡情況等，每周稱一次體重。

1.3.2大鼠子宮形態的觀察:第90天，處死大鼠，取出子宮進行形態比較和稱重。

1.3.3 血清生化指標:第90天，各組大鼠經股動脈采血，離心制備血清，用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定其中的Ca、P、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨鈣素(bone gla protein，BGP)水平。

1.3.4 股骨物理量的測定:一側股骨用雙能X線骨密度儀測定其密度;另一側用游標卡尺測定長度。

1.4 統計學處理方法

所有數據以均數±標準差表示，采用SPSS10.0統計軟件包進行方差分析。組間比較采用LSD法(least significant difference)。

2 結果

2.1 一般觀察

受試大鼠在實驗期間生長發育狀況良好;模型對照組在去卵巢40 d后出現明顯煩躁不安、多動等癥狀。

2.2 子宮形態變化

從圖1可以看出:與正常組相比，模型對照組子宮明顯萎縮(圖A)，而補充了SBEF－Ca的低、中、高劑量組的子宮(圖B)，其重量和大小明顯大于模型對照組子宮。圖1見彩插4。

2.3 各組大鼠的股骨密度和長度見表1。

表1 各組大鼠的股骨密度和長度(±s，n=8)Tab.1 Femur density and length of tested rats(±s，n= 8)

表1 各組大鼠的股骨密度和長度(±s，n=8)Tab.1 Femur density and length of tested rats(±s，n= 8)

注:相同字母代表組間比較差異無顯著性(P＞0.05)，不同字母代表組間比較差異有顯著性(P＜0.05)，其他表格相同。Note:The same letter means no significant difference(P＞0.05)，and vice versa(P＜0.05).The same in other tables.

組別Group股骨密度Density(g/cm2)股骨直徑Diameter(cm)正常Normal 0.13±1.01a3.41±0.09a模型對照Model 0.11±0.15b3.25±0.08b低劑量Low－dose 0.12±0.17ab3.31±0.14ab中劑量Medium－dose 0.12±0.12ab3.34±0.06ab高劑量High－dose 0.13±0.01a3.31±0.14ab

由表1可知，摘除卵巢可使大鼠股骨密度顯著減小(模型對照組與正常組相比，P＜0.05)。各劑量組大鼠的股骨密度與正常組相比差異無顯著性，且高劑量組的股骨密度顯著高于模型對照組和低、中劑量組。說明SBEF－Ca可抑制卵巢摘除造成的股骨密度降低趨勢，并使其維持在正常水平，并且高劑量SBEF－Ca的效果優于低、中劑量。同理，卵巢摘除造成模型大鼠的股骨長度顯著變短，而SBEFCa可扭轉這種變短的趨勢，并使股骨長度維持在正常水平，但各劑量組之間差異不顯著。因此卵巢摘除使大鼠股骨密度降低，長度變短，骨量減小，導致骨質疏松，而補充SBEF－Ca，可有效防止骨質疏松的發生。

2.4 血清生化指標測定結果

2.4.1 血鈣、血磷測定結果:由表2結果顯示，各組大鼠的血Ca和血P水平與正常組相比，差異不顯著，故卵巢摘除和SBEF－Ca對血鈣和血磷水平沒有影響。

表2 各組大鼠的血鈣和血磷水平(±s，n=8)Tab.2 The serum Ca，P levels of the rats(±s，n=8)

表2 各組大鼠的血鈣和血磷水平(±s，n=8)Tab.2 The serum Ca，P levels of the rats(±s，n=8)

組別Groups血鈣serum Ca(mmol/L)血磷Serum P(mmol/L)正常Normal 1.60±0.19a1.46±0.34a模型對照Model 1.79±0.98a1.49±0.14a低劑量Low－dose 1.77±0.23a1.37±0.26a中劑量Medium－dose 1.70±0.10a1.26±0.26a高劑量High－dose 1.62±0.07a1.50±0.10a

2.4.2 ALP、BGP測定結果:從表3可以看出，模型對照組血清ALP水平顯著高于正常組;中、低劑量組ALP水平與模型對照組相比有降低趨勢，并趨近正常組水平(P＞0.05);高劑量組ALP水平則顯著低于模型對照組和中、低劑量組，并與正常組相比差異無顯著性;可見卵巢摘除會引起大鼠ALP水平顯著增加，各劑量的SBEF－Ca均可使ALP水平下降到正常水平，并且高劑量組的效果要優于低、中劑量組。

同理，卵巢摘除也使血清BGP水平顯著升高;而各劑量組都保持在正常水平，并且高、中劑量組的效果(P＞0.05)要優于低劑量組。

表3 大鼠血清中的堿性磷酸酶水平和骨鈣素水平(±s，n=8)Tab.3 The serum ALP and BGP levels in the rats(±s，n=8)

表3 大鼠血清中的堿性磷酸酶水平和骨鈣素水平(±s，n=8)Tab.3 The serum ALP and BGP levels in the rats(±s，n=8)

組別Group堿性磷酸酶ALP(mmol/L)骨鈣素BGP(ng/mL)正常Normal 13.69±8.64c3.36±0.35bc模型Model 18.20±3.94a6.64±2.04a低劑量Low－dose 16.94±6.46ab4.91±2.46ab中劑量Medium－dose 16.16±11.45ab4.54±0.49c高劑量High－dose 14.55±7.38c3.44±1.38c

3 討論

3.1 骨質疏松動物模型的復制

雌二醇在骨代謝過程中發揮重要作用，具有抑制破骨細胞活性，減少骨吸收，促進骨形成和骨生長的作用。卵巢摘除后，大鼠體內雌激素驟然缺乏，導致破骨細胞溶解骨質形成骨洞的作用超過成骨細胞形成骨質填充骨洞的作用，引起骨質疏松。骨質疏松的診斷以骨密度減小為主要依據。大鼠切除卵巢后，股骨密度降低尤為明顯［9］。本研究大鼠去卵巢后90 d時，模型對照組大鼠股骨骨密度顯著低于正常組。雌激素直接影響子宮重量，子宮萎縮是卵巢成功切除的典型標志［10］，本研究中模型對照組子宮明顯萎縮，子宮重量也顯著減小，說明動物骨質疏松模型復制成功。

3.2 反映骨代謝的生化指標

鈣、磷平衡受甲狀旁腺素(PTH)、降鈣素(CT)、VD等多種因素的調節和控制。本研究建立了骨質疏松模型并證實了SBEF－Ca對骨質疏松的防治作用，但各組大鼠的血Ca和血P水平差異不顯著，故血清Ca、P水平不能作為反映骨代謝的特異性指標。

成骨細胞分泌ALP并釋放入血，當肝和胎盤等功能正常時，血清ALP可作為骨形成的有效特異性指標。血清BGP是由非增殖期成骨細胞特異合成和分泌的一種非膠原骨蛋白，其主要功能是維持骨的正常礦化速率，抑制異常的羥基磷灰石結晶的形成，是反映骨更新(骨形成和骨再建)的一項特異性生化指標。一般認為ALP的升高是伴隨著骨吸收的亢進而出現的代償性骨形成增加引起的。模型對照組ALP和BGP水平明顯升高，說明骨吸收亢進，骨更新加速，代償性骨形成增加;補充SBEF－Ca后，伴隨著骨密度恢復到正常水平，ALP和BGP水平也恢復到正常水平，故而ALP和BGP可作為反映骨代謝的特異性指標。

3.3 SBEF-Ca對骨質疏松的防治作用

本研究證實SBEF－Ca可有效抑制和扭轉絕經后骨質疏松癥的發生和病變進程。其作用與雷諾昔酚(raloxifene，RAL)、三苯氧胺(tamoxifen，TAM)以及萘氧啶(nafoxidine，NAF)相似，Sato等［11］發現這三種雌激素受體調節劑具有阻止去卵巢大鼠骨密度降低的作用并呈劑量依賴關系。SBEF－Ca對骨密度的影響雖無劑量依賴性，但高劑量組的防治作用顯著優于低劑量組和中劑量組。RAL不增加去卵巢大鼠的子宮重量，而雌激素和TAM則使去卵巢大鼠的子宮重量顯著增加［12，13］。Hidaka等［7］報道蜂王漿(royal jelly，RJ)和蛋白酶處理過的蜂王漿(pRJ)能有效防治骨質疏松，其效果可與17β－雌二醇相比，其機制為促進了腸道對鈣的吸收，而不是通過對PTH的直接拮抗作用。與本研究不同的是，RJ和pRJ都沒有使子宮重量增加，說明二者對雌激素和雌激素受體的活性沒有影響［7］。SBEF－Ca使去卵巢大鼠子宮重量明顯增加，因而其對骨質疏松的防治機理除促進腸道對鈣的吸收外，還可能同時改變了雌激素或雌激素受體的活性［14］，或者其中含有雌激素樣的活性肽。

Hidaka等［7］用蛋白酶水解RJ是為了促進腸道對Ca的吸收，結果證實pRJ的骨質疏松防治效果優于RJ。大量研究證實蛋白質并非在腸道內徹底分解為游離氨基酸才被人體吸收利用，大多是以小肽形式消化吸收，而以游離氨基酸形式吸收的比例很小，并且小肽的吸收比游離氨基酸的吸收更為迅速。SBEF－Ca中，蛋白肽含量約為42.4%，鈣含量為21.1%，并且大部分為氨基酸螯合鈣的形式。在其制備過程中植物乳桿菌和戊糖片球菌發酵使羊骨膠原的胃蛋白酶水解產物進一步水解，并可吸收再利用產生的游離氨基酸。短肽中的絲氨酸磷酸和氨基酸能夠選擇性地與Ca結合，提高了Ca的生物利用度并有助于Ca的腸道轉運和吸收。

鈣的充足攝入并不能有效預防骨質疏松的發生，還需要有骨膠原的補充，因為骨組織是由骨基質和骨礦物質構成的復雜有機體，80%～90%的骨礦物質為鈣和磷，骨基質主要是骨膠原蛋白［5］。Jung等［15］利用酶法制備的鈣螯合肽有效提高了去卵巢大鼠對鈣的生物利用率。營景穎［16］也證實膠原多肽螯合鈣是一種優良的功能性補鈣制劑，其壯骨作用以及對骨質疏松的防治作用均優于葡萄糖酸鈣和碳酸鈣。

王玲［17］研究表明:高濃度的強骨丸有明顯抑制骨吸收的作用，低濃度的強骨丸抑制效果不顯著。本實驗參照此實驗設計不同灌胃劑量，并且低劑量的SBEF－Ca(1000 mg/kg·d，ig)對骨質疏松就具有了防治作用。

3.4 SBEF-Ca的安全性

目前各種骨質疏松防治藥物安全性引起人們的擔憂。雙磷酸鹽可引起腸胃不適和消化不良以及下頜骨易碎。激素替代療法增加了某些癌癥的患病風險，以及容易引起中風和腦血栓，其使用風險要遠遠高于人們所預想。雌激素受體調節物雖沒有嚴重不良反應，但同降鈣素和特立帕肽一樣，只能減少脊柱裂，而不能減少股骨骨裂和其他類型的骨裂。每日服用雷洛昔芬容易引起流感綜合征、潮紅、腿痛性痙攣、外周性水腫等，并且引起高發血栓栓塞性疾病的發病率與雌激素替代療法相似［18］。各種藥物的臨床研究還不充分和完善，在藥物劑量、用藥方案及人群選擇方面都值得進一步探討。理論上，各種療法的聯用將起到協同作用，然而，明胺丁羥磷酸鹽會降低特立帕肽的療效，故這兩種藥物不能同時使用［19］，其他藥物能否聯用，需要深入研究。

SBEF－Ca制備時，原料為羊骨，加工方式為安全的蛋白酶酶解和微生物發酵，因而是一種天然、安全、有效的制劑，無毒副作用，可替代其他療法用于骨質疏松的長期防治。

(本文圖1見彩插4。)

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Effect of SBEF-Ca on Bone M ineral Density and Biochem ical Param eters of Bone M etabolism in Rats w ith Osteoporosis

HUO Nai－rui1，MA Li－zhen2，XIN Xin3，KONG Bao－hua3，CHEN Hong－fang2，LU Jun3
(1.Faculty of Food Science and Engineering，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China; 2.Food Science Department，Tianjin Agricultural College，Tianjin 300384; 3.Food Science department，Northeast Agricultural University，Haerbin 1500302)

Objective The purpose of this study was to investigate the preventive and therapeutic role of sheep bone enzymatic fermentation－calcium chelate(SBEF－Ca)against osteoporosis.M ethods Forty 3.5－month－old Sprague－Daw ley rats were random ly divided into normal group(sham+water，ig)，model control group(ovariectomized+water，ig)，and three dosage groups(ovariectomized+SBEF－Ca，ig).From 12 days after ovariectomy，the rats were treated with water or SBEF－Ca intragastically，respectively，for 11 weeks.Then the femoral bone mineral density(BMD)and femoral length，as well as the main parameters of bone metabolism were measured.ResultsBoth the femoral BMD and the length were significantly decreased in the model control group，and all the dosage groups reversed the declining tendency and brought them to the level of normal group.BMD of the high－dosage group was markedly higher than that of model group and the other two dosage groups.There were no statistically significant differences in the femur length among dosage groups.The serum Ca and P levels of all rats had no significant differences.An apparent rise of alkaline phosphatase(ALP)and bone gla protein(BGP)occurred in the model control group，but these two parameters of all dosage groups had no significant differences compared with those of the normal group(P＜0.05).ALP level of the highdose group was significantly lower than that of the low and medium dosage groups.The BGP levels of the medium and highdosage groups were significantly lower than that of the low dose group.ConlusionAll the low，medium and high dosages of SBF－Ca show preventive effect on the occurrence of postmenopausal osteoporosis in rats.

Sheep bone enzymatic fermentation－calcium chelate;Ovariectomized rats;Bone m ineral density; Biochem ical parameters

R151.4+1

A

1005－4847(2010)03－0216－05

2009－10－26

山西省回國留學人員科研資助項目(2009038);天津市科技攻關項目(No.05ZHGCNC00100)。

霍乃蕊(1972－)，女，博士，副教授;研究方向:生物工程。E－mail:tgnrhuo@163.com;

馬儷珍，E－mali:malizhen－6329@163.com