水溶性殼聚糖對血管平滑肌細胞增殖的影響

費 瑜,劉賢英,李桂榮,才 華,費 瑞

(1.吉林大學第二醫院,吉林長春130041; 2.吉林大學白求恩醫學院,吉林長春130021)

水溶性殼聚糖對血管平滑肌細胞增殖的影響

費 瑜1,劉賢英1,李桂榮1,才 華2,費 瑞2

(1.吉林大學第二醫院,吉林長春130041; 2.吉林大學白求恩醫學院,吉林長春130021)

通過化學方法測定了水溶性殼聚糖(water-solubility chitosan,WSC)的部分理化性質;通過原代分離培養大鼠腹主動脈平滑肌細胞和MTT實驗,研究了1,10,100和1000μg/mL的WSC對血管平滑肌細胞的增殖作用.實驗結果表明,WSC溶解度為125,含水量13.19%,脫乙酰度54.73%,重均相對分子質量1.17×105.在24 h和48 h時,大于10μg/mL的WSC可抑制原代培養的血管平滑肌細胞的增殖.其中,100和1000μg/mL的WSC在48 h時對細胞的增殖的抑制作用最明顯,表明在一定條件下,WSC可抑制血管平滑肌細胞增殖,減輕由血管平滑肌細胞增殖所引起的血管狹窄問題.

水溶性殼聚糖;血管平滑肌細胞;增值

0 引言

血管狹窄(restenosis,RS)是血管創傷愈合的系統反應,涉及血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)、內皮細胞、血小板、炎癥細胞和血液蛋白之間的復雜作用.其中,VSMCs的遷移和增殖是導致血管狹窄的重要環節[1-2].Clowes等研究發現,在大鼠頸動脈模型中,血管中層的VSMCs在損傷后幾小時內即開始增殖,第4天遷移至內膜;14～21 d VSMCs數目增加為原來的3～5倍,占最終內膜細胞數目的90%[3].近年來,應用藥物防治血管狹窄問題逐漸受到重視[4].一些抗血栓形成藥物、血管擴張劑、抗增生藥物及降血脂藥物等,盡管能選擇性地抑制某一活性因子,使血管狹窄得到緩解,但并沒有使再狹窄的發生得到控制[5].因此,開發一種安全有效的抑制VSMCs增殖的藥物,對降低冠心病經皮冠狀動脈介入(percutaneous coronary intervention,PCI)治療后血管狹窄的發生具有十分重要的臨床意義.

水溶性殼聚糖(water-solubility chitosan,WSC)是殼聚糖的降解產物,它除具備殼聚糖原有的特點外,還具有易溶于水和利于吸收利用等特點,因此在生物醫學領域具有極高的應用前景[6].Kosuzuki等實驗證明,殼聚糖及其衍生物可抑制腫瘤細胞的生長和轉移[7];劉曉宇等研究發現,兩性殼聚糖在體內對T淋巴細胞的增殖有顯著的刺激活性,但在體外對小鼠淋巴細胞增殖無影響[8].一些研究還顯示,低分子殼聚糖(low molecular weight chitosan,LMWC)具有結合膽酸、降低膽固醇、升高 HDL-C/TC的作用,表明LWMC可用于血管狹窄的防治[9].本實驗通過體外原代培養大鼠腹主動脈VSMCs,探討了WSC對VSMCs增殖的影響,為進一步開發抑制血管狹窄的藥物提供了實驗依據.

1 材料與方法

1.1 材料

WSC(青島海普);膠原酶Ⅱ(Invitrogen);四唑鹽(Genview);二甲基亞砜(Sigma).

1.2 設備

顯微鏡(日本,OLYMPUS);酶標儀(Austria,T ecan A-5082);高效液相色譜儀(日本,SHIMADZU).

1.3 動物

體重(150±10)g SD大鼠(SPF),由吉林大學白求恩醫學院動物中心提供,合格證號:吉實動質(2000)-042號.實驗前在室內常規飼養2 d.

1.4 實驗方法

1.4.1 WSC溶解度測定

室溫下精確量取100 mL蒸餾水注入錐形瓶,同時準確稱取WSC并逐漸加入錐形瓶,直至液體變為凝膠狀.三次重復,取平均值.利用下列公式計算WSC溶解度:

式中,G1為原有的WSC質量(g),G2為剩余的WSC質量(g).

1.4.2 WSC含水量測定

準確稱取一定質量的WSC,在25℃恒溫干燥箱中烘干至恒重.三次重復,取平均值.利用下列公式計算含水量:

式中,G1和G2分別為烘干前后的糖樣品質量(g).

1.4.3 WSC脫乙酰度測定

將WSC樣品放于干燥箱中,25℃烘干至恒重.準確稱取0.3 g樣品置于250 mL錐形瓶中;先加入標準0.1 mol/L鹽酸溶液30 mL,室溫(20℃～25℃)下溶解完全;再加入5 mL混合指示劑(V(1%甲基橙)∶V(1%苯胺藍)=1∶2).用0.05 mol/L氫氧化鈉溶液滴定至錐形瓶中溶液剛好變色,即為滴定終點.重復三次,取平均值,按下列公式計算脫乙酰度:

式中,G1為鹽酸標準溶液的濃度(mol/L);C2為氫氧化鈉標準溶液的濃度(mol/L);V1為加入的鹽酸標準溶液的體積(mL);V2為滴定的氫氧化鈉標準溶液的體積(mL);G為樣品質量(g).

1.4.4 相對分子質量測定

采用高效液相色譜法(HPLC)測定.儀器:SHIMADZU LC-l0Atm(Japan);監測器:SHIMADZU RID-10A;工作站:CLASS VP;色譜柱:TSK-GEL,G-4000 PWXL,7.8(ID)×30.0 cm(L);流動相: 0.9%NaCl;流速:0.5 mL/min;柱溫:40℃;壓力:1.6 MPa;進樣量:20μL.

1.4.5 大鼠腹主動脈VSMCs的提取和培養

處死大鼠,分離胸腹主動脈,D-Hanks液漂洗2～3次.剪去血管外脂肪及結締組織,剖開血管,刮去內膜細胞.將動脈置于含10%FBS的DMEM中,37℃5%CO2培養箱孵育12 h;取出剪碎,放入2 g/L膠原酶后,繼續孵育12 h.取出,離心收集細胞,加入含20%FBS的DMEM,放入37℃5%CO2培養箱中培養.2～3 d后更換新鮮培養液;5 d左右,細胞融合達到70%～80%時,進行傳代和純化.

1.4.6 大鼠腹主動脈VSMCs的純化

取一細胞生長良好的培養瓶,加入少量0.25%的胰蛋白酶消化細胞,制成細胞懸液.然后,將細胞懸液移入新培養瓶中靜置15 min,收集培養液并放入另一培養瓶,再次靜置15 min.重復上述步驟2次,離心.加入新鮮含10%FBS的DMEM培養液,于37℃5%CO2培養箱中培養.α-actin標記為陽性用于實驗研究.

1.4.7 WSC對大鼠腹主動脈VSMCs增殖的影響

采用MTT比色法測定VSMCs的增殖結果.取6代以內細胞,加無血清培養基培養12 h,進行血清饑餓同步化處理.然后,用0.25%胰蛋白酶消化,制成細胞懸液,以每孔5×103個細胞的密度接種于3塊96孔板,即每孔接種細胞懸液200μL.將細胞分成對照組和實驗組,每組6個復孔.對照組加入含10%FBS的DMEM;實驗組分別加入不同質量濃度(1,10,100和1000μg/mL)的WSC,每孔50μL,分別作用24,48和 72 h.在培養結束前4 h,吸去培養液,每孔加入新配置的 0.4%的 MTT溶液100μL,繼續培養4 h.小心吸去培養液,加入150μL二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min,然后迅速用酶標儀在492 nm處測量各孔吸光值D(492).

1.5 統計分析

實驗數據以平均值±標準差表示.統計的差異顯著性由ANOVA(方差)檢驗.概率值P<0.05為統計的顯著性,P<0.01為統計的極顯著性.

2 結果

2.1 WSC溶解度測定結果

室溫下WSC的溶解度為125.溶解過程中,WSC呈棕褐色,遇水即溶,表明WSC有良好的水溶性.

2.2 WSC含水量測定結果

如表1所示,WSC的含水量為13.19%,表明該糖為較干燥的樣品.

表1 WSC含水量測定

2.3 WSC脫乙酰度測定結果

用標準0.1 mol/L NaOH溶液滴定WSC的終點是測試液變成橙黃色.實驗結果如表2所示,WSC的脫乙酰度為54.73%.

表2 WSC脫乙酰度測定

2.4 WSC相對分子質量測定結果

如圖1所示,經HPLC法測定,WSC重均相對分子質量約為1.17×105.WSC有3個主要的峰,出峰時間分別為:11.906,13.657和15.357 min,所占峰面積分別為47.39%,16.81%,12.97%,說明樣品的相對分子質量主要由這3種多糖組分決定.另外,由圖1可見:第一個峰所占面積遠大于其他各峰,說明樣品中此相對分子質量的多糖含量最高.

圖1 WSC的HPLC分析

2.5 WSC對平滑肌細胞增殖的影響

MTT測定結果(見表3)表明:作用24 h時,隨濃度增大,WSC對細胞的抑制作用加大.當質量濃度大于10μg/mL時,WSC對細胞的抑制作用與對照組相比有顯著性差異(P<0.05).作用48 h時, WSC對細胞的抑制作用呈明顯濃度依賴性,其中,質量濃度大于100μg/mL時,WSC對細胞的抑制作用與對照組相比有極顯著性差異(P<0.01).作用72 h后,細胞增殖能力減弱,各組細胞生長變化差異不明顯(P>0.05).

表3 WSC對平滑肌細胞的增殖作用

3 討論

許多研究證實,化學改性劑、衍生物及溶劑等都影響殼聚糖的基本性能,從而使其生理功能發生變化[10-11].WSC是殼聚糖的降解產物,因此對WSC理化性質的研究有利于全面了解該成分的活性.脫乙酰度表征了乙酰化與脫乙酰化之間的平衡程度,說明了殼聚糖中自由氨基的含量,脫乙酰度大小直接影響到殼聚糖的結晶性、溶解性及一些重要的生理活性等.實驗證明,脫乙酰度越高、相對分子質量越小,越易溶于水,其中,脫乙酰度在45%～55%之間的殼聚糖水溶性較好[12].本實驗測定的WSC的脫乙酰度為54.73%,其溶解度(125)與上述結論相吻合.為進一步搞清WSC的理化性質,我們又對其含水量和相對分子質量進行了測定.實驗測得,WSC的含水量為13.19%,重均相對分子質量是1.17×105.

研究表明,殼聚糖及其衍生物對腫瘤細胞有強烈的抑制作用;而LMTC也可通過干擾細胞膜的正常結構,阻止生長因子與細胞膜上受體的結合,實現細胞增殖抑制[13-14].實驗證明,大鼠主動脈血管內皮損傷后,VSMCs大量增殖,約占整個新生內膜細胞總數的88.8%[15].因此,本實驗根據以往文獻,分離了大鼠腹主動脈VSMCs,研究了WSC對該VSMCs生長的抑制作用.實驗結果發現,在48 h以內, WSC均能在一定范圍內抑制大鼠腹主動脈VSMCs的增殖,其中,WSC在100,1000μg/mL時顯現出最好的抑制效果.分析原因很可能與WSC的較強水溶性有關,具體機制有待進一步證實.另外,實驗結果還表明,當細胞培養72 h時,細胞增殖能力減弱,WSC的作用不明顯.分析原因可能與細胞生長狀態有關.因為原代培養的細胞對營養、生存空間等條件要求較高,細胞的大量增殖使細胞生長環境惡化,導致部分細胞死亡,細胞增殖能力降低,從而影響實驗結果[16].

我們的實驗證明,WSC在一定條件下對VSMCs的增殖有明顯的抑制作用,可進一步開發成治療血管再狹窄的高效、低不良反應藥物.

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(責任編輯:方 林)

Effect of water-soluble chitosan on the proliferation of vaseular smooth muscle cells

FEI Yu1,LIU Xian-ying1,LI Gui-rong1,CAI Hua2,FEI Rui2

(1.Second Hospital,Jilin University,Changchun 130041,China; 2.School of Norman Bethune Medical Science,Jilin University,Changchun 130021,China)

To assay the physical and chemical properties of water-soluble chitosans(WSC)by chemical method,and to research the effect of WSC,in the concentration of 1,10,100 and 1000μg/mL,on proliferation of vascular smooth muscle cells by the separating big the aorta smooth muscle cells of rats and MTT experiment.Results show that WSC solubility,moisture content and deacelation degree were respectively 125,13.19%and 54.73%,molecular weight was 1.17×105.WSC of more than 10μg/mL concentration of 24 h or 48 h,could inhibit the proliferation of vascular smooth muscle cells.Especially when in the concentration of 100μg/mL and 1000μg/mL of 48 h,WSC could obvious inhibit cells proliferation.These results showed that under certain conditions,WSC can inhibit vascular smooth muscle cells proliferation,reduce restenosis caused by vascular smooth muscle cells.

water-soluble chitosans;vascular smooth muscle cells;proliferation

Q 946.3[學科代碼]180·5120

A

1000-1832(2010)04-0121-05

2010-05-23

吉林省科技發展計劃項目(200705354).

費瑜(1963—),男,博士研究生,主任醫師,主要從事心血管介入治療研究;通訊作者:費瑞(1964—),男,博士,教授,主要從事多糖生物活性研究.