大鼠急性心肌梗死模型的制備及對肌鈣蛋白T的影響

郝 迪，王 蕾，李 旭，種影影，呂 楠，康 利，陳衛平

(天津市醫藥科學研究所，天津 300020)

研究報告

大鼠急性心肌梗死模型的制備及對肌鈣蛋白T的影響

郝 迪，王 蕾，李 旭，種影影，呂 楠，康 利，陳衛平

(天津市醫藥科學研究所，天津 300020)

目的探討建立大鼠急性心肌梗死(AMI)模型的方法，研究心肌梗死大鼠血漿中肌鈣蛋白 T(cTn－T)的動態變化。方法大鼠經結扎左冠狀動脈前降支造成心肌梗死，建立穩定的心肌梗死模型;分別在結扎后31 h、48 h、69 h、168 h檢測cTn－T含量和計算心肌梗死重量指數 。結果成功制備心肌梗死大鼠模型，并對常規技術進行改進，降低動物死亡率。大鼠左冠狀動脈結扎31 h、48 h模型組與假手術組 cTn－T含量差異極顯著(P ＜0.001);各時間點心肌梗死重量指數比較，差異極顯著(P＜0.001)。cTn－T值與梗死重量指數呈顯著性正相關(r =0.90，P＜0.01)。結論結合大鼠心肌梗死程度進一步佐證了模型制備較成功。cTn－T表現出特異性和敏感性，并在31 h最接近達峰時間，有早期診斷心肌梗死的價值，也可作為判斷AMI時心肌梗死程度和預后的參考指標。

急性心肌梗死;肌鈣蛋白T;大鼠

心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是常見的心血管內科疾病，嚴重危害著人類的健康。心肌梗死后梗死區域內心肌細胞的變性壞死、梗死邊緣處組織的轉變以及心肌細胞壞死后的不能再生，這些原因可引起心室重構、心輸出量減少，影響局部或整體的心功能，嚴重者導致死亡。人們常利用心臟是區域性供血的特點，結扎主要的一條冠狀動脈分支，中斷血流，導致某一區域心肌的壞死，制備AMI模型，再現體內病理狀態和病理生理過程。動物實驗中主要是結扎大鼠左冠狀動脈前降支(LAD)作為最常用的AMI模型，但制備該類模型中面臨的最大問題就是死亡率仍然較高［1，2］，本文就如何建立較為穩定的大鼠 AMI模型并降低死亡率提出了一些建議。肌鈣蛋白T(cTn－T)被視為AMI新的診斷標志物，對其研究越來越受到重視，最近，歐洲心臟病學會(ESC)、美國心臟病學會(ACC)對AMI進行了重新定義［3］，將 cTn－T增高作為診斷心肌損傷的最主要條件。為此，筆者特對 cTn－T在AMI中的早期診斷意義進行探討，旨在通過對大鼠AMI模型技術的改進建立的大鼠急性心肌梗死模型，從cTn－T和心肌梗死變化方面檢驗模型的構建情況，觀察其變化規律并找出其血漿峰值的敏感時間以期對研究缺血性心臟病動物模型提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SD大鼠，購自北京大學醫學部實驗動物科學部［SCXK(京)2006－0008］，雄性，體重220±10 g。每天為大鼠提供普通全價顆粒飼料II號，由北京科澳協力飼料有限公司生產［京動許字(2000)第015號］。動物飲用純凈水。標準化實驗室，實驗動物使用許可證號SYXK(津)2007－0001。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組:取健康大鼠56只，按體重隨機分為假手術對照組和AMI模型組，每組28只，每個時間點取7只。

1.2.2 大鼠AMI模型制作:SD大鼠經1% 戊巴比妥鈉45～50 mg/kg腹腔注射麻醉后，背位固定于手術臺上，無菌操作下沿大鼠左腋下與胸骨劍突連線處切開皮膚，逐層鈍性分離肌肉，將面罩罩住大鼠口鼻連接人工呼吸機(參數設定為:呼吸比1∶3，潮氣量32，呼吸頻率60)，沿4、5肋間開胸，分離心包膜，擠出心臟至可見肺動脈圓錐，以0號線于左心耳根部下方2 mm處進針，在肺動脈圓錐旁出針，深度為0.3～0.5 mm結扎LAD［4］，心臟復位后迅速擠出空氣關閉胸腔，制造胸腔負壓狀態，縫合肌肉皮膚。假手術對照組在相同條件下，穿過針線后不結扎。術后測定Ⅱ導聯心電圖，以心電圖作為大鼠AMI納入標準，若術后心電圖 ST段抬高較術前未超過0.2 mV且QRS波群無明顯變化，則為模型未成功不納入試驗使用。

1.2.3 心梗后不同時間測定 cTn－T:分別在心梗后31 h、48 h、69 h和168 h腹主動脈取血，測定血漿中cTn－T含量。

1.2.4 心肌梗死大鼠梗死重量指數:分別在不同時間點將心臟取下，用生理鹽水沖洗3遍，除去血污，剔除血管、脂肪等非心肌組織，用濾紙吸除水分，沿冠狀溝切除心房和右心室，留下左心室。順房室溝從心尖到心室底部平行將左心室切成0.1 cm厚的心肌片。切片后將左心室放在0.2%NBT溶液中37℃水浴環境染色5 min，梗死區域呈現未染色的灰白色，未梗死區域呈現 NBT與脫氫酶反應后的藍色，切下灰白色區域稱重即為梗死心肌重量，再稱取非梗死心肌重量，與梗死心肌重量相加計算得出左心室重量，用梗死心肌重量/左心室重量，即為梗死重量指數［5］。

1.2.5 統計學處理:所得數據均經 SPSS11.5統計軟件組間t檢驗處理，數據以均數±標準差(±s)表示，cTn－T與梗死重量指數比較采用直線相關回歸分析。

2 結果

2.1 冠脈結扎大鼠不同時間段梗死重量指數

實驗組大鼠心肌梗死重量指數均明顯高于假手術組(P＜0.001)，該心肌梗死模型制備較成功(表1)。

表1 AMI大鼠不同時間段梗死重量指數Tab.1 Infarct ponderal index in deferent time in AMI rats

2.2 肌鈣蛋白

模型組cTn－T在31 h和48 h與假手術組有顯著性差異，即該手術方法較成功，且在31 h最接近達峰時間，可見cTn－T出現的時間早，特異性和敏感性強，可以作為早期診斷AMI的指標(表2)。

表2 AMI大鼠不同時間段肌鈣蛋白含量Tab.2 The vale of cTn－T in deferent time in AMI rats

2.3 cTn-T與梗死重量指數關系

cTn－T值與梗死重量指數呈顯著正相關(r= 0.90，P＜0.01)。

3 討論

動物實驗中觀察 AMI指標的敏感性和參考價值直接取決于如何建立穩定的急性大鼠AMI模型，減少動物死亡率，從而進行缺血性心臟病其它指標的研究。本文就大鼠心梗模型建立過程進行了大樣本探索，就經驗提出幾點建議:1.采用結扎冠狀動脈制備心肌梗死模型首先要過麻醉關。因該模型制備需時較長，故采用腹腔注射麻醉，較為方便、實用。我們使用的麻醉藥物有戊巴比妥鈉進行腹腔麻醉，大鼠術后蘇醒快，無呼吸道分泌物，無麻醉意外，死亡率低。實驗中我們主張，麻醉要一次到位，中途加量往往使動物蘇醒時間延長至少1 h，影響大鼠存活率。我們發現，凡麻醉效果好、蘇醒及時的大鼠，死亡率就低。2.本模型最關鍵的一步是LAD的定位及結扎。因此，如何準確結扎冠脈及早期判斷模型成功與否，值得深入研究。實驗中一些大鼠造模后死亡，解剖發現，結扎過于靠上、過緊，造成心衰而死亡。結扎時要快、準，打結時不宜過度牽拉;否則，易切割心肌組織，造成嚴重的心肌損傷。開胸結扎完心臟后迅速放入胸腔，并用止血鉗及時關閉胸腔，時間短暫，可不用氣管插管。3.觀察心電圖是否逐漸出現ST段弓背向上抬高及病理性Q波等指標作為納入標準。4.心律失常的預防及處理術，給利多卡因10 mg/kg預防室性心律失常，術中、術后出現者可隨時補加，若出現室速、室顫，應同時給予胸外擠壓，一般可糾正。出現過緩性心律失常，可給予阿托品、異丙腎予以糾正，但對于合并術后心電圖 R波迅速降低者，說明梗死面積過大，搶救少有成活者。5.術后感染的預防及控制 術前可將所有手術器械高壓滅菌，臨使用前用75% 酒精消毒。將手術區皮毛剃干凈后，先用碘酒涂擦，再用酒精消毒皮膚 手術切口盡量小，術后給青霉素3 d至一周。

cTn－T作為一種新型AMI診斷標志物，由于其出現時間早、高特異性、高敏感性，因而具有較大的臨床應用價值，成為臨床上早期判斷心肌梗塞的重要依據。CTn是緊密附著于收縮纖維上的調節蛋白，由3個亞基組成:肌鈣蛋白T(cTn－T)、肌鈣蛋白I(cTn－I)、肌鈣蛋白C(cTn－C)。cTn－T和cTn－I心肌特異性好，已作為胸痛患者首選的常規心肌壞死標志物檢查。心肌中的cTn－C與骨骼肌中的cTn－C相同，沒有心肌特異性，較少用于心肌損傷的檢查。cTn－T在心肌壞死時釋放入血［6，7］，是心肌損傷最特異的診斷指標，cTn－I也是心肌損傷特異性標志物，其性質與意義和 cTn－T相同，在 AMI后出現的時間、高峰時間與 cTn－T平行。本動物實驗著重觀察了 cTn－T在心肌梗塞大鼠中的動態變化。cTn－T在心肌細胞膜完整狀態下，不能透過細胞膜進入血循環，故假手術組大鼠血液中含極低量的肌鈣蛋白，當大鼠左冠狀動脈結扎后，心肌細胞發生變性壞死，細胞膜破損，cTn－T彌散進入細胞間質，較早地出現在外周血中。研究其在大鼠心肌梗死中出現的動態變化，可以最早佐證心肌梗死動物模型建立成功，節省動物。實驗結果顯示，在31 h左右 cTn－T較其他時間點更接近達峰時間。鑒于cTn－T的敏感性與特異性較其他心肌酶高，故建議可以選擇31 h左右作為心梗實驗中檢測 cTn－T時間，也有利于評價藥物療效。本文結果證實，cTn－T值與梗塞重量指數有較好的相關性，呈顯著正相關，提示在不同的實驗研究設計中，通過測定cTn－T，可以動態監測和評價AMI變化。

從AMI的臨床表現來看，一些患者可能不完全符合WHO關于AMI診斷標準，但卻伴有心肌損傷標志物cTn－T升高，美國心臟病學學會(ACC)以及美國心臟學會(AHA)認為在心肌梗死患者中，cTn－T值升高可確立ST段未升高的AMI的診斷，因此，在后繼的研究中我們將進一步研究只納入 ST段未升高的LAD結扎大鼠cTn－T的含量，從而進一步探討cTn－T在AMI早期診斷中的重要意義。

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Model Establishment of Acute Myocardial Infarction and Its Effects on cTn-T

HAO Di，WANG Lei，LI Xu，CHONG Ying－ying，LV Nan，KANG Li，CHEN Wei－ping
(Tianjin Institute of Medical and Pharmaceutical Sciences，Tianjin 300020，China)

ObjectiveTo establish the model of AMI rats and to evaluate the dynamic changing of cTn－T. Methods Model of myocardial infarction were established by ligation of the left anterior descending branch，then detected cTn－T and infarct weight after ligating 31 h，48 h，69 h，168 h on AMI rats。ResultsThere was remarkable difference of cTn－T between model group and sham operation group at 31 h and 48 h(P ＜0.001);infarct weight of model group was higher than that of sham operation group(P ＜0.001).Blood plasma cTn－T peak value showed positive correlation with the infarct ponderal index(r=0.90，P ＜0.01)。Conclusions The variability of cTn－T plays an important role on early diagnosis in AMI，the value of cTn－T is a reference index for estimating infarction and prognosis.

Acute myocardial infarction;cTn－T;Rat

R542.2+2

A

1671－7856(2010)05－0021－03

2009－12－04

郝迪(1977－)，從事心腦血管藥物研發。

陳衛平(1953－)，副教授，從事心腦血管藥物研發。